Klastritega regulaarselt vahelduvate lühikeste palindroomsete korduste (CRISPR) meetod on kolmanda põlvkonna genoomi redigeerimise tehnika, mis on oma suure läbilaskevõimega tulemustega maailma revolutsiooniliselt muutnud. Seda on kasutatud mitmesuguste bioloogiliste haiguste ja infektsioonide raviks. Erinevatel bakteritel ja teistel prokarüootidel (näiteks arhedel) on samuti CRISPR/Cas9 süsteemid faagide vastu kaitsmiseks. On teatatud, et CRISPR/Cas9-põhised strateegiad võivad pärssida kolmiknegatiivse rinnavähi (TNBC) kasvu ja progresseerumist, sihtides potentsiaalselt muutunud resistentsusgeene, transkriptsiooni ja epigeneetilist regulatsiooni. Need terapeutilised sekkumised võivad aidata lahendada keerulisi probleeme, nagu ravimiresistentsus, mida on täheldatud isegi TNBC-s. Praegu kasutatakse CRISPR/Cas9 sihtrakkudesse viimiseks mitmesuguseid meetodeid, näiteks füüsikalisi (mikroinjektsioon, elektroporatsioon ja hüdrodünaamilised režiimid), viiruslikke (adeno-assotsieerunud viirus ja lentiviirus) ja mitteviiruslikke (liposoomid ja lipiidide nanoosakesed). Kuigi TNBC molekulaarsete põhjuste uurimiseks on välja töötatud mitmesuguseid mudeleid, piirab tundlike ja sihipäraste meetodite puudumine genoomi redigeerimise tööriistade in vivo manustamiseks nende kliinilist rakendamist. Kokkuvõttes uurib see ülevaade põhjalikult CRISPR/Cas9 ravi edusamme, väljakutseid, piiranguid ja väljavaateid TNBC korral olemasolevate tõendite põhjal. Samuti toome esile, kuidas tehisintellekti ja masinõppe kombinatsioon saab parandada CRISPR/Cas9 strateegiaid TNBC ravis.
Vähki iseloomustab kontrollimatu rakkude jagunemine, rakutsükli kontrollpunktide häired ja mutatsioonid kasvaja supressorgeenides (TSG-des) (Matthews jt, 2022). Erinevat tüüpi vähivormide seas on rinnavähk naistel kõige levinum vähiliik ja sellel on kogu maailmas kõrge suremus (Waks ja Winer, 2019). Rinnavähk on heterogeenne haigus, millel on mitmekesised omadused, nagu histoloogilised ja bioloogilised tunnused, kliiniline pilt ja käitumine ning ravivastus (Weigelt jt, 2010). Rinnavähi klassifikatsioon annab täpse ülevaate rinnavähi diagnoosimisest ja kasvaja prognoosimisest. Rinnavähi klassifitseerimise peamiseks kriteeriumiks on olnud levinud biomarkerite ja kliinilis-patoloogiliste tunnuste kasutamine (Tsang ja Tse, 2019). Rinnavähi prognoosi ja ravivastust mõjutavad arvukad tegurid, sealhulgas östrogeeniretseptori (ER), progesterooniretseptori (PR), inimese epidermaalse kasvufaktori retseptori 2 (HER2/neu) olemasolu ning histoloogiline aste, kasvaja tüüp ja suurus ning lümfisõlmede metastaasid (Al-Tubaiti, 2020). On tuvastatud viis rinnavähi intrinsilise molekulaarset alatüüpi, sealhulgas luminaalne A, luminaalne B, HER2-rikastatud, basaalselaadne ja klaudiinivaba (Prat jt, 2015). TNBC on vähi molekulaarne alatüüp, mis ei ekspresseeri kõiki ER-i, PR-i ja HER2-d (Yin jt, 2020). Need patoloogilised tunnused on seotud TNBC-ga, kinnitades selle kiiret progresseerumist ja agressiivsemat olemust kui ükski teine rinnavähi tüüp (Feng jt, 2018). Lisaks kasutasid Peru jt (2000) mikrokiibi tehnoloogiat rinnavähi ümberklassifitseerimiseks ja viie rinnavähi intrinsilise alatüübi tuvastamiseks (Cadenas, 2012). Basaalselaadne rinnavähk on rinnavähi alatüüp, millel on kolmiknegatiivne fenotüüp ja mis on seotud kiire progresseerumisega. Tuleb märkida, et kõiki basaalseid rinnavähke diagnoositakse sageli valesti TNBC-na, kuid ainult 77% on TNBC; Seevastu 71–91% TNBC-dest on basaalsed, mis näitab, et need kaks rinnavähi tüüpi kattuvad ja esindavad erinevaid klassifikatsioone (Wang D.-Y. jt, 2019). See loob vajaduse iseloomustada TNBC heterogeensust, et selgitada prognoosi ja teha kindlaks võimalikud ravivastused praegustele ja tulevastele ravimeetoditele. Lisaks moodustab TNBC 15–20% kõigist rinnavähi juhtudest ja on sagedasem alla 50-aastastel naistel. BRCA1 või BRCA2 mutatsioone on teatatud ligikaudu 20% TNBC juhtudest (Xie jt, 2017; Tzikas jt, 2017). , 2020). Uuringud on ka näidanud, et TNBC-l on selgelt eristuv immuunmikrokeskkond, mis hõlmab veresoonte endoteeli kasvufaktorite, kasvajaga seotud makrofaagide (TAM-ide), kasvajasse infiltreeruvate lümfotsüütide (TIL-ide) ja teiste kasvaja kasvu ja migratsiooniga seotud molekulide kõrget taset. Seetõttu on TNBC mikrokeskkonna mõistmine kriitilise tähtsusega selle prognoosi ja ravi seisukohast (Fan ja He, 2022).
TNBC prognoosi hindamiseks ja efektiivse ravi tagamiseks on oluline täpne diagnoos, mis põhineb peamiselt immunohistokeemial (IHC) ER, PR ja HER2 tuvastamiseks ning mammograafial rinnakasvajate tuvastamiseks. Mammograafia ei suuda aga piisavalt kujutada kasvajasiseseid tunnuseid, nagu nekroos ja fibroos (Deepak Singh jt, 2021). Kuna halb prognoos ja diagnoos takistavad arstidel õigete ravimite väljakirjutamist (Chaudhary, 2020), kasutatakse TNBC-ga patsientide ravi parandamiseks mitmesuguseid strateegiaid. Praegu kasutatakse TNBC-ga patsientidel kahte ravimit, doksorubitsiini ja tsüklofosfamiidi, ning need on näidanud häid tulemusi. Lisaks kasutatakse ka teisi plaatinaravimeid, näiteks karboplatiini ja tsisplatiini (Sikov jt, 2015). Lisaks on PARP inhibiitoreid, nagu olaparib, velaparib ja PF-01367338, kasutatud potentsiaalsete keemiaravi ravimitena TNBC raviks (Ishino jt, 2018). Kuna on teatatud, et Wnt/b-kateniini, NOTCH ja Hedgehog signaaliülekande rajad on seotud TNBC tekke ja progresseerumisega, võib ravimite suunamine nendele radadele olla oluline strateegia (Aysola jt, 2013). Kuigi kirurgia, kiiritusravi ja keemiaravi jäävad tänapäeval TNBC ravi peamiseks elemendiks, on tehtud märkimisväärseid edusamme uute ravimeetodite väljatöötamisel, sealhulgas sihipärane ravi, immunoteraapia, mitmesugused CRISPR-iga seotud geenitöötlusvahendid, nagu Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing ja CRISPR/Cas9-sihitud geeniteraapia. Siin keskendume erinevatele CRISPR-iga seotud geenitöötlusvahenditele, mida kasutatakse TNBC ravis. Nende hulgas on CRISPR/Cas9 pälvinud laialdast tähelepanu.
Cas9n, tuntud ka kui Cas9 nikaasi, on Cas9 valgu geneetiliselt muundatud variant, mis on saadud CRISPR/Cas9 genoomi redigeerimissüsteemist (Gupta jt, 2019). Algsel kujul sisaldab Cas9 valk kahte nukleaasi domeeni: RuvC ja HNH, mille peamine ülesanne on mõlema DNA ahela lõhustamine. Cas9n-is aga muteerub üks nukleaasi domeenidest, HNH, geneetiliselt ja muutub inaktiivseks. Seetõttu jääb Cas9n HNH domeen mittefunktsionaalseks. Ainult RuvC domeen jääb aktiivseks, võimaldades Cas9n-il lõigata või luua katkestusi üksikutel DNA ahelatel (Trevino ja Zhang, 2014). Võrreldes Cas9-ga suudab Cas9n tõhusalt vähendada sihtmärgiväliseid efekte ja täpselt parandada rakkude parandamise mehhanisme. Cas9n-i saab kasutada mitmesuguste probleemide lahendamiseks, näiteks katkestuste loomiseks kindlates kohtades kaheahelalises DNA-s. Sel eesmärgil kombineeriti ja kasutati koos kahte Cas9n molekuli (Yee, 2016). Segatüüpi kinaas 3 (MLK3) on mitogeeni poolt aktiveeritud proteiinkinaas, mis toimib TNBC metastaaside ajal võtmeregulaatorina (Cronan jt, 2012).
MLK3 võib aktiveerida mitmeid signaaliülekandeteid, mis viivad TNBC metastaasideni. Näiteks reguleerib c-Jun N-terminaalse kinaasi (JNK) rada rakkude liikuvust ja rakuvälise maatriksi lagunemist ning MLK3 aktiveerib JNK raja, suurendades seeläbi rakkude liikuvust ja andes invasiivseid omadusi (Rattanasinchai ja Gallo, 2016). MLK3 reguleerib ka EMT-d. Selleks aktiveerib see allavoolu transkriptsioonifaktoreid nagu Snail, Slug ja Twist. Need faktorid pärsivad epiteeli markerite ekspressiooni ja soodustavad mesenhümaalsete markerite ekspressiooni, mis viib metastaatilise fenotüübi omandamiseni (Casalino jt, 2023). On täheldatud, et MLK3 mängib rolli rakuvälise maatriksi (ECM) ümberkujundamises ja selliste proteaaside nagu maatriksi metalloproteinaaside (MMP-de) aktiveerimises, mis lagundavad ECM-i. See hõlbustab kasvajarakkude invasiooni ja levikut kaugematesse kohtadesse (Katari jt, 2019). Seega on varasemad uuringud näidanud, et MLK3 mängib TNBC-s kriitilist rolli. Rattanasinchai ja Gallo uurisid MLK3 rolli TNBC mudelite abil ja leidsid, et see soodustab vähi arengut spetsiifiliste signaaliradade kaudu. Nad kasutasid MLK3 redigeerimiseks CRISPR/Cas9n-i ja täheldasid TNBC metastaaside olulist vähenemist (Rattanasinchai ja Gallo, 2016).
dCas9, mida sageli nimetatakse inaktiivseks Cas9-ks, on Cas9 valgu modifitseeritud derivaat. Erinevalt aktiivsest Cas9-st puudub dCas9-l endonukleaasi aktiivsus, mistõttu see ei suuda indutseerida DNA kaksikahela katkemisi. Seetõttu saab dCas9 abil sihtida täpselt genoomi spetsiifilisi piirkondi ilma DNA järjestust muutmata või modifitseerimata (Wang jt, 2016). dCas9-s inaktiveeritakse kaks endonukleaasi valku, RuvC ja HNH, oluliste aminohappejääkide pärssimise teel. (Richter jt, 2016). Vaatamata DNA lõhustamisaktiivsuse puudumisele mängib dCas9 mitmeid olulisi rolle geeniuuringutes ja biotehnoloogias. Näiteks võimaldab see visualiseerida genoomi spetsiifilisi piirkondi, hõlbustab transkriptsioonilist regulatsiooni ja soodustab epigeneetilisi modifikatsioone (Brocken jt, 2018).
Transkriptsioonifaktor ZEB1 (tsinksõrme E-box siduv homeoboksi 1) mängib spetsiifilist ja kriitilist rolli epiteeli-mesenhümaalse ülemineku (EMT) vahendamisel, mis on rakuline protsess, mis toimub embrüonaalse arengu, kudede parandamise ja vähi progresseerumise ajal. See hõlmab epiteelirakkude transformatsiooni mesenhümaalseteks rakkudeks, mille tulemuseks on muutused rakkude morfoloogias, liikuvuses, invasiivsuses jne. (Wu jt, 2020). ZEB1 inhibeerib mitmeid epiteeli markereid, nagu E-kadheriin ja oklüdiin, mis vastutavad rakkudevahelise adhesiooni ja epiteelirakkude polaarsuse säilitamise eest TNBC-s (Moreno-Bueno jt, 2008). Lisaks aktiveerib ZEB1 teatud markereid, nagu N-kadheriin, vimentiin ja fibronektiin (Konradi jt, 2014), ning reguleerib ka tsütoskeleti ümberkujunemisega seotud geene, nagu Rho GTPaasid ja maatriksi metalloproteinaasid (MMP-d) (Huang jt, 2014). 2022), lisaks mõjutab see ka mitmesuguseid signaaliülekandeid, nagu transformeeriv kasvufaktor β (TGF- β ), Wnt signaaliülekanne jne, soodustades seeläbi kasvaja invasiooni ja metastaase TNBC-s (Chen jt, 2016). Arvukad uuringud ja teaduslikud tõendid näitavad, et ZEB1-l on suur potentsiaal väärtusliku ainena TNBC avastamisel ja terapeutilisel sekkumisel. Hiljutises uuringus kasutasid Waryah jt TNBC mudelit ja saavutasid ZEB1 täieliku supressiooni dCas9 abil. Seega täheldasid nad in vivo tingimustes väga kõrget spetsiifilisust ja peaaegu täielikku ZEB1 inhibeerimist (Waryah jt, 2023).
CRISPR/Cas12 on geenide redigeerimise tööriist nimega CRISPR/Cpf1. See on tuletatud CRISPR/Cas süsteemist, kus termin Cas12 viitab CRISPR-iga seotud valgule 12 (Bharathkumar jt, 2022), mis on täiesti sarnane Cas9-ga. Ainus erinevus on see, et see sisaldab Cas12 valku. Võrreldes Cas9-ga on Cas12-l mõned unikaalsed funktsioonid, näiteks kleepuvate otste genereerimine geenide redigeerimise käigus, samas kui Cas9 genereerib nürisid otsi (Wang jt, 2021). See Cas12 omadus aitab kaasa selle spetsiifilisele DNA manipuleerimise tehnoloogiale. Valguna, mis on võimeline sihtmärk-DNA-d täpselt ära tundma ja lõikama, on see erakordselt mitmekülgne, muutes selle tõhusaks tööriistaks mitmesuguste rakenduste jaoks, sealhulgas geenide redigeerimiseks (Pickar-Oliver ja Gersbach, 2019).
Sarnaselt teistele CRISPR-i variantidele on ka CRISPR/Cas12 võimeline TNBC-s geene välja lülitama või aktiveerima, sihtides geene, millel on oluline roll selle patogeneesis või ravivastuses (Yang ja Zhang, 2023). Selle protsessi saavutamiseks töötati välja juht-RNA (gRNA), mis suunab Cas12 sihtgeeni juurde. Kui Cas12 seondub oma sihtmärgiga, tekitab see DNA-s kaheahelalisi katkemisi ja aktiveerib DNA parandusmehhanisme. Parandusprotsessi käigus võidakse lisada valesid nukleotiide, mis viib geenimutatsioonide ja funktsiooni kadumiseni (Zhang jt, 2021a). Lisaks kasutati geenide aktiveerimiseks ka Cas12 ensüümi täiustatud versiooni (nimega dCas12). Selle kombineerimisel transkriptsiooni aktivaatoriga on võimalik indutseerida teatud geene, aktiveerides neid seeläbi. Sellel tehnoloogial on suur potentsiaal kasvaja supressorgeenide aktiveerimise edendamisel (Sultan jt, 2022).
Prime editing on äsja väljatöötatud ja äärmiselt parem genoomi redigeerimise tehnoloogia. See on võimeline organismi DNA-d väga täpselt muutma (Chen ja Liu, 2023). Prime editing saavutatakse kahe peamise komponendi integreerimise teel: modifitseeritud CRISPR/Cas9 ensüüm ja pöördtranskriptaas. CRISPR/Cas9 ensüümi roll on selektiivselt sihtida genoomis täpseid saite, samas kui pöördtranskriptaas aitab DNA-d sihtkohas põhjalikult muuta (Hassan jt, 2021). Praimerite redigeerimise mehhanismis hõlmab esimene samm praimerite redigeerimise juht-RNA (pegRNA) loomist (Standage-Beier jt, 2021). See sisaldab sihtjärjestust ja RNA matriitsi, mis vastab soovitud redigeerimissaidile siht-DNA-s. Seejärel viiakse pegRNA koos praimerite redigeerimise nukleaasiga (PE2) sihtrakkudesse. PE2 on fusioonvalk, mis koosneb Cas9 ensüümist, pöördtranskriptaasist ja praimerite redigeerimise adapterist (Martín-Alonso jt, 2021). Rakus otsivad pegRNA ja PE2 kompleksid spetsiifilist DNA-d, mida nad soovivad muuta. Cas9 ensüüm lõikab DNA-d ja loob üksikutest ahelatest koosneva matriitsi (Choi jt, 2022). Pöördtranskriptaas kasutab seda matriitsi DNA ettevalmistamiseks redigeerimiseks. Lisaks DNA kopeerimisele on lisatud ka juhised RNA matriitsi redigeerimiseks. Lõpuks kasutatakse äsja loodud DNA ahelat matriitsina DNA katkestuse parandamiseks, mille tulemuseks on muudetud DNA järjestus, mis sisaldab soovitud modifikatsiooni (Ochoa-Sanchez jt, 2021). Praimerite redigeerimismehhanismid võivad viia geenides laialdaste mutatsioonideni. See võib sihtida punktmutatsioone, insertsioone, deletsioone ja isegi geenide asendusi (Anzalone jt, 2019; Chen ja Liu, 2023). Praimerite redigeerimine pakub varasemate genoomi redigeerimise tehnoloogiate ees mitmeid eeliseid. Nende hulka kuuluvad suurem täpsus, vähem sihtmärgiväliseid efekte ja võimalus redigeerida DNA-d ilma DNA kaheahelaliste katketeta (Anzalone jt, 2020).
CRISPR/Cas9 tehnoloogia töötati algselt välja bakterite kaitsmiseks plasmiidiülekande ja faagiinfektsiooni eest ning hiljem võeti see uuesti kasutusele tõhusa RNA-põhise DNA sihtimisvahendina genoomi redigeerimiseks (Jiang ja Doudna, 2017). Lisaks on teatatud, et CRISPR/Cas9 süsteem esineb vastavalt 50% ja 87% bakterite ja arhede genoomides (Ishino jt, 2018). CRISPR/Cas9 on potentsiaalne tööriist mis tahes ebanormaalse geneetilise järjestuse deletsiooniks, sisestamiseks ja korrigeerimiseks, kasutades nii in vivo kui ka in vitro režiime (Sabit jt, 2021). Lisaks on näidatud, et CRISPR/Cas9 on osa adaptiivsest immuunsüsteemist tänu oma spetsiifilisusele huvipakkuvate sihtgeenide suhtes (Chen ja Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 koosneb Cas9-st ja ühest juht-RNA-st (sgRNA). Cas9 on endonukleaas, mis koosneb mitmest valgukomponendist. Lisaks on Cas9-l ainulaadsed struktuurilised ja konformatsioonilised omadused (Pacesa jt, 2022), kuna see koosneb kahest sagarast: äratundmis- (REC) ja nukleaasi- (NUC) sagarast. REC-sagar jaguneb edasi kolmeks piirkonnaks: REC1, REC2 ja sildheeliksid (Cromwell jt, 2018). NUC koosneb kolmest sagarast, nimelt RuvC-st (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH-st ja protospacer-naturated motif (PAM) interaktsioonidomeenist (joonis 1) (Song jt, 2016). sgRNA koosneb kahest komponendist, sealhulgas CRISPR RNA-st (crRNA) ja transkodeerivast väikesest RNA-st (tracer RNA) (joonis 1). sgRNA ühendab Cas9 valgu konneksiinidega, moodustades aktiivse kompleksi, mida tuntakse ka efektorkompleksina (Richter jt, 2012). crRNA on 18–20 nukleotiidi pikkune aluspaar, millel on kriitiline roll siht-DNA järjestuste äratundmisel. Lisaks paardub crRNA siht-DNA-ga ja tracrRNA toimib Cas9 nukleaasi jaoks tugiraamistikuna siht-DNA sidumiseks (Manghwar jt, 2019). Teisest küljest on PAM-järjestusel 3 nukleotiidi, mis kinnitab, täpsustab ja vahendab efektorkompleksi seondumist DNA-ga. Cas9 valgukompleksi allüksused RuvC ja HNH omavad katalüütilist aktiivsust (Richter jt, 2012; Asmamaw ja Zawdie, 2021). Cas9 allüksuse HNH nukleaasi domeen lõhustab crRNA-ga seotud DNA ahelat. RuvC nukleaasi domeen lõhustab teisi DNA ahelaid ja tekitab kaheahelalisi katkemisi (DSB-sid), mille järel aktiveeritakse kaks erinevat DNA katkemise parandamise mehhanismi (Jiang ja Doudna, 2017) (joonis 1).
Joonis 1. CRISPR/Cas9 ülevaade (A). CRISPR/Cas9 süsteemi komponendid: (i). Cas9 endonukleaas vastutab siht-DNA järjestuse lõikamise eest, (ii) üks juht-RNA (sg), mis tuleneb crRNA ja tra-crRNA kimääride liitmisest. (kaks). Cas9 sisaldab mitmeid komponente, nagu Rec I, Rec II, NUC lobe (HNH ja Ruv C on alamkomponendid) ja PAM interaktsioonidomeen (C) vastavate funktsioonidega. CRISPR/Cas9 valgukompleks lõikab DNA järjestused mittekomplementaarseteks ja komplementaarseteks vormideks (D). CRISPR/Cas9 redigeerib genoomi kolmes etapis: äratundmine, lõikamine ja parandamine. Kujundatud sg-RNA juhib Cas9-t ja tunneb soovitud järjestuse ära komplementaarse komponendi crRNA kaudu. Cas9 tunneb ära PAM järjestuse 5'-NGG-3' juures ja sulatab DNA, moodustades DNA-RNA hübriidi ja aktiveerides lõhustumise. Cas9 HNH domeen lõikab komplementaarset ahelat ja RuvC domeen lõikab mittekomplementaarset ahelat. CRISPR/Cas9 parandab kaheahelalist DNA-d, lõhkudes seda kahel viisil: mittehomoloogse otste ühendamise (NHEJ) ja homoloogiapõhise parandamise (HDR) abil. NHEJ parandab kaheahelalist DNA-d võõra homoloogse DNA puudumisel ensümaatilise protsessi abil, mis on veale kalduv mehhanism, mis suudab sisestada või eemaldada juhuslikke DNA järjestusi. HDR on väga spetsiifiline ja nõuab homoloogseid DNA malle.
CRISPR/Cas9-vahendatud parandusrajad hõlmavad mittehomoloogseid otste ühendamise (NHEJ) ja homoloogiapõhiseid parandusmehhanisme (HDR). NHEJ on veaohtlik rada, kuna see hõlmab sisestamist või deletsiooni ega vaja parandusmehhanismi ajal mingit mustrit. See kasutab standardsete valkude genereerimiseks juhuslikke nukleotiide (Abbasi jt, 2021). See parandussüsteem koosneb neljast kompleksist, näiteks KU kompleksist, ristkomplementeeriva valgu kompleksi tüübist 4 (XRCC-4), DNA otsa töötlemise ensüümist ja proteiinkinaasi DNA-PKcs-st (Abbasi jt, 2021). KU kompleksvalgul on kaks subühikut, Ku 70 ja Ku 80, ning see mängib olulist rolli NHEJ mehhanismis, kuna parandusmehhanism käivitub kahe subühiku (Ku 70 ja Ku 80) seondumisega siht-DNA nüride või peaaegu nüride otstega (Abbasi jt, 2021), mis toimib tugistruktuurina teiste NHEJ-ga seotud faktorite värbamiseks vigastuskohta (Yang jt, 2020). XRCC-4 ja DNA ligaas koosnevad vastavalt 334 ja 911 aminohappest ning XRCC4-DNA ligaasi IV kompleks stimuleerib DNA otste ligeerimist (Chatterjee jt, 2015). DNA otste töötlemise ensüüm, tuntud ka kui polünukleotiidkinaas 3'-fosfaat, on DNA otste töötlemise ensüüm. See suudab eemaldada DNA-st 3'P rühma ja fosforüülida 5'OH rühma kaheahelalise DNA katke parandamise ajal. See hõlmab ka üheahelaliste katkete (SSB-de) parandamist SSB parandamise raja abil (Chatterjee jt, 2015). Proteiinkinaas DNA-PKcs on DNA-sõltuv proteiinkinaas, mis koosneb PIKK-de (fosfatidüülinosiitool-3-kinaasiga seotud kinaasid) ja ataksia telangiektaasia muteerunud (ATM) perekonna katalüütilisest allüksusest, samuti ATM-i ja Rad3-ga seotud ATR-idest, ahelakatkestustest (DSB-dest) ja üheahelalistest katkemistest (Yue jt, 2020; Peng jt, 2016).
HDR on täpsem ja sobivam parandusmehhanism, kuna informatsioon kopeeritakse homoloogse DNA dupleksi terve vormi abil, kuigi see nõuab õdekromatiidide olemasolu. See toimub imetajate rakutsükli S/G2 faasis. HDR esineb peamiselt pärmseliikides, kuid NHEJ on imetajatel kriitilise tähtsusega (Burma jt, 2006; Abbasi jt, 2021). Täielik parandusmehhanism on näidatud joonisel 1.
Kuna TNBC-d põhjustavad geneetilised ja epigeneetilised kõrvalekalded, võib pahaloomuliste genoomsete/epigenoomsete kõrvalekallete korrigeerimine CRISPR/Cas9 abil olla mõistlik terapeutiline lähenemisviis (Chen jt, 2019). Lisaks võivad mõned rakuspetsiifilises transkriptsiooniregulatsioonis osalevad transkriptsioonifaktorid omada vähirakkude ainulaadseid omadusi, mis viitab sellele, et transkriptsiooniregulatsioon võib olla suurepärane lähenemisviis vähiravis (Drost jt, 2017). Nende kasvajate molekulaarsete tunnuste, näiteks geneetiliste, epigeneetiliste ja transkriptsiooniliste defektide ärakasutamine ravimite väljatöötamiseks võib parandada kliinilisi tulemusi ja vähendada sõeluuringute kulusid. CRISPR on potentsiaalne geenide redigeerimise tööriist, mis mitte ainult ei suuda tuvastada ja tuvastada vähki põhjustavaid genoomseid sihtmärke, vaid seda saab kasutada ka onkogeenide redigeerimiseks, supresseerimiseks ja epigeneetiliseks modifitseerimiseks inimese rakkudes (tabel 1) (Ahmed jt, 2021). Kasvaja supressorite, onkogeenide ja ravimiresistentsusega seotud geenide otsimiseks on läbi viidud mitu CRISPR-sõeluuringut. CRISPR/Cas9 kasutamine erinevate TNBC onkogeenide redigeerimiseks on näidatud joonisel 2.
Joonis 2. Erinevate TNBC onkogeenide geenitöötlus CRISPR/Cas9 abil, mille tulemuseks on kasvaja kasvu ja metastaaside vähenemine. Nende onkogeenide hulka kuuluvad CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 ja CXCR7, Crypto1, ROR1 ja ST8SIA, mis on seotud TNBC tekke ja metastaasidega.
Vähirakkude migratsioon, invasioon ja epiteeli-mesenhümaalne üleminek (EMT) on seotud ITGA9-ga. Varasemad uuringud on näidanud, et ITGA9 on Notchi raja võtmetegija ja mängib huvitavat rolli rabdomüosarkoomi metastaasides (Molist jt, 2020). Lisaks leiti, et ITGA9 on tihedalt seotud patsientide prognoosiga mitmete kasvajatüüpide, sealhulgas rinnavähi korral (Wang Z. jt, 2019). Lisaks näitas ITGA9 bioinformaatiline analüüs, et selle ekspressioon TNBC-s oli oluliselt kõrgem kui teistes rinnavähi alatüüpides. Kõrgenenud ITGA9 tasemed on seotud kasvaja metastaaside ja retsidiividega TNBC patsientidel. ITGA9 väljalülitamine CRISPR/Cas9 poolt põhjustas vähi tüvirakkudele (CSC) sarnaseid omadusi, kasvaja angiogeneesi, kasvaja kasvu ja metastaaside vähenemist, soodustades β-kateniini lagunemist TNBC-s (Wang Z. jt, 2019).
Krüpto-1 kuulub TGF-β perekonda ja on kriitilise tähtsusega varajase embrüogeneesi, tüvirakkude säilimise ja vähi metastaaside tekke jaoks (Ishii jt, 2021). Tuntud ka kui Tdgf-1, on see onkogeenne GPI-ankurdatud signaalirada, mis osaleb primitiivse vööti, mesodermi ja endodermi moodustumise regulatsioonis, samuti vasaku/parema asümmeetria tekkimises kehaorganite arengus embrüogeneesi ajal (Zhang jt, 2021b). Lisaks on näidatud, et Cripto-1 osaleb epiteeli-mesenhümaalses üleminekus (EMT) tüvirakkude markerina (Zhang jt, 2021b). EMT on kriitilise tähtsusega mitte ainult mitmesuguste protsesside, näiteks embrüonaalse arengu, fibroosi ja haavade paranemise, vaid ka vähi invasiooni ja metastaaside tekke jaoks. Lisaks on näidatud, et Cripto-1 interakteerub nelja Notch-retseptoriga ja soodustab nende translatsioonijärgset küpsemist (Brandstadter ja Maillard, 2019). Notch-i signaalirada on teadaolevalt seotud inimese rinnavähirakkude säilimisega. Uuringud on näidanud, et CRISPR/Cas9-vahendatud Crypto-1 väljalülitamine pärsib vähi kasvu ja metastaase. Seetõttu võib Crypto-1-st saada oluline terapeutiline sihtmärk TNBC korral (Castro jt, 2015).
XCL12 valk ja selle kemokiini retseptor CXC (CXCR4 ja CXCR7) mängivad vähirakkude proliferatsioonis, kasvus, migratsioonis ja invasioonis mitmesuguseid rolle (Wu jt, 2015). Neid kemoretseptoreid on seostatud TNBC arenguga mitmete signaaliradade kaudu nii in vivo kui ka in vitro mudelites (Wu jt, 2015). Lisaks on CXCR4 ja CXCR7 aktiveerimine seotud suurema metastaaside tekke ja halva prognoosiga TNBC korral (Karn jt, 2022). Seetõttu võivad CXCR4 ja CXCR7 väljalülitamine muutuda tõhusateks ravimite sihtgeenideks rinnavähi, sealhulgas TNBC ravis. Yang jt uuringus. Yang jt (2019) kasutasid CRISPR/Cas9 CXCR4 ja CXCR7 geenide kaasväljalülitamiseks ning leidsid, et TNBC proliferatsioon, kasv, migratsioon ja invasioon olid oluliselt pärsitud (Yang jt, 2019).
Rinnavähi kudedes on täheldatud miR-3662, TNBC onkogeeni, suurenenud taset (Yi jt, 2022). On näidatud, et miR-3662 vaigistamine pärsib rinnavähi kasvu ja metastaase nii in vivo kui ka in vitro (Agarwal ja Gupta, 2021). HBP-1 on Wnt/-kateniini signaaliülekande tugev inhibiitor ja tõenäoliselt vastutab miR-3662 vahendatud TNBC rakkude kasvu eest. Hiljuti leidsid Yi jt, et miR-3662-HBP1 telg reguleerib Wnt/-kateniini signaaliülekande rada TNBC rakkudes (Yi jt, 2022). Tänu oma kasvajaspetsiifilisele ekspressioonile võib miR-3662 olla potentsiaalne terapeutiline sihtmärk TNBC jaoks. Seega võib CRISPR/Cas9 vahendatud miR-3662 vaigistamine olla suurepärane lähenemisviis uute ravimite väljatöötamiseks TNBC raviks.
UBR5 on 300 kDa nukleofosfoproteiin, mis on identifitseeritud kui tuumorigeneesi, metastaaside ja immuunvastuse peamine regulaator erinevates vähivormides (Shearer jt, 2015; Fu jt, 2023). UBR5 on teatatud olevat TNBC proovides tugevalt ülesreguleeritud ja stimuleerib ERα funktsiooni, indutseerides proliferatsiooni oma ubikvitiini ligaasi aktiivsuse kaudu (Bolt jt, 2015). Primaarsete TNBC proovide täieliku eksoomi sekveneerimise uuringud näitasid samuti UBR5 ekspressiooni suurenemist, mis viitab selle rollile TNBC arengus. Lisaks näitas CRISPR/Cas9-indutseeritud UBR5 deletsioon TNBC metastaaside ja kasvu olulist pärssimist eksperimentaalsetes hiiremudelites. Lisaks taastas UBR5 lisamine metsiktüüpi hiiremudelisse selle täieliku funktsionaalsuse, samas kui seda efekti ei täheldatud inaktiveeritud mutantsete tüvede puhul (Liao jt, 2017). UBR5 puudumine on seotud suurenenud apoptoosi, nekroosi ja tuumori kasvu pärssimisega TNBC-s nõrga angiogeneesi tõttu. UBR5 kadumise tõttu väheneb kasvaja levik kaugematesse organitesse ja UBR5 indutseerib ebanormaalset EMT-d peamiselt E-kadheriini ekspressiooni vähendamise kaudu (Zhang ja Weinberg, 2018). Hiljuti näidati, et UBR5 on IFN-γ-indutseeritud PDL1 transkriptsiooni väga oluline tegur TNBC-s, kuna sellel puudub E3 ubikvitinatsiooni aktiivsus. RNA transkriptoomi analüüs näitas, et UBR5-l võib olla süsteemne toime IFN-γ rajaga seotud geenidele ja see võib soodustada PDL1 transaktivatsiooni, suurendades proteiinkinaasi RNA (PKR) ja selle signaaliülekande ja aktivaatorite, transkriptsioon 1 (STAT1) ja interferooni regulatiivse teguri 1 (IRF1) aktivatsioonitasemeid. CRISPR/Cas9-vahendatud UBR5 ja PD-L1 ekspressiooni kombineeritud ablatsioonil on aga sünergistlik terapeutiline toime kui kummalgi blokaadil eraldi, avaldades sügavat mõju kasvaja mikrokeskkonnale (Wu jt, 2022). Seega võib CRISPR/Cas9 olla oluline vahend UBR5 funktsiooni pärssimiseks, pärssides seeläbi TNBC metastaase ja kasvaja kasvu.
ROR1 on I tüüpi transmembraanne valk, mida ekspresseeritakse vähi ja embrüonaalse arengu ajal ning mis on identifitseeritud onkofetaalse valguna (Nicholas Borcherding, 2014). Erinevate inimese vähivormide invasiivne käitumine on seotud ROR1 ülesreguleerimisega. Paljulubavaid tulemusi on saadud in vivo ja in vitro uuringutest, mis hõlmavad ROR1-d sihtivaid terapeutilisi ühendeid (Chien jt, 2016). ROR1 mRNA kõrgenenud taset rinnakoe biopsiates on seostatud ka agressiivsete basaalsete rinnakasvajate (BL) ja nende migratsiooniga keha teistesse osadesse. Lisaks on ROR1 üleekspressioon identifitseeritud kui TNBC arengu prognostiline marker (Chien jt, 2016). ROR1 vaigistamine CRISPR/Cas9 abil TNBC kasvu ja metastaaside pärssimiseks oleks aga tõhus strateegia.
Sialüülimisprotsess hõlmab siaalhappe lisamist glükokonjugaatidele, mida katalüüsivad sialüültransferaasid (ST-d). ST8SIA1 kuulub ST perekonda ja mängib olulist rolli mitmesuguste haiguste, näiteks lümfotsütaarse leukeemia ja kolorektaalse vähi patogeneesis (Chang jt, 2018). RNA järjestuse analüüs näitab, et ST8SIA1 ekspresseerub kõrgelt TNBC patsientide rinnakoes ja on positiivses korrelatsioonis kasvaja supressorgeeni p53 mutatsioonidega, mis võivad kaasa aidata TNBC patogeneesile (Battula jt, 2017). Lisaks osaleb ST8SIA1 TNBC metastaaside ja kordumisega, mis viitab sellele, et sellel on oluline roll TNBC esinemises ja arengus. TNBC in vitro mudelis näidati, et ST8SIA1 vaigistamine CRIPSR/Cas9 poolt blokeerib kasvu ja metastaase (Battula jt, 2017). See viitab sellele, et CRISPR/Cas9 võib olla oluline vahend ST8SIA1 onkogeeni funktsiooni pärssimiseks TNBC ravis.
NAT1 on metaboolne ensüüm, mis katalüüsib II faasi ksenobiootiliste ühendite moodustumist ja mida ekspresseeritakse peaaegu kõigis inimese kudedes. NAT1 saab kasutada kofaktor folaati atsetüül-CoA (atsetüül-CoA) sihtimiseks isegi aromaatse amiini substraadi puudumisel (Stepp jt, 2015; Laurieri jt, 2014). Uuringud on näidanud, et NAT1 reguleerib maatriksi metalloproteinaas 9 (MMP9) funktsiooni rinnavähi rakumudelites ja kaitseb reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) eest glükoosinälgimise ajal (Wang jt, 2018). NAT1 deletsioon on näidanud, et see pärsib püruvaatdehüdrogenaasi kompleksi, mis viib mitokondriaalse düsfunktsioonini (Wang L. jt, 2019). Lisaks on mitmed teised aruanded näidanud, et NAT1 inhibeerimine väikeste molekulide ja siRNA vaigistamise abil võib vähendada rinnavähirakkude invasiivsust ja proliferatsiooni (Stepp jt, 2018). Hiljuti kasutati CRISPR/Cas9-t NAT1 supresseerimiseks rinnavähi rakuliinis MDA-MB-231, mõjutades rakkude ainevahetust sõltuvalt selle ekspressioonitasemest. See uuring näitas ka, et NAT-1 on kriitilise tähtsusega TNBC progresseerumisel ja metastaaside tekkemisel (Carlisle jt, 2020).
Onkogeenide koordineeritud transkriptsiooni reguleerivad supervõimendajad, transkriptsioonifaktorid ja kofaktorid (Hnisz jt, 2015). Lisaks on transkriptsiooni regulatsiooniks vajalik rühm tsükliin-sõltuvaid kinaase (CDK), näiteks CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 ja CDK13. Nende hulgas osaleb CDK7 RNA polümeraas II fosforüülimises, mis on väga oluline onkogeeni transkriptsiooni initsieerimiseks ja laienemiseks TNBC patogeneesis. Ühes olulises uuringus pärssis CDK7 deletsioon CRISPR/Cas9 poolt TNBC-d, mis näitab, et TNBC patogenees on CDK7-st sõltuv (Wang Y. jt, 2015).
Uuringud on näidanud, et mutatsioonid MYC-s ja RBP-s (RNA-d siduv valk) võivad viia apoptoosini, samas kui üksiku geeni mutatsioonid MYC-s või RBP-s ei mõjuta vähirakkude kasvu (Einstein jt, 2021). CRISPR/Cas9-põhise teeki abil on skriinitud üle 1000 RBP inimese genoomis. Nende hulgast leiti, et 57 RBP-d on kriitilise tähtsusega vähirakkude kasvuks, millel on väga kõrge MYC tase (Wheeler jt, 2020). Lisaks on YTHDF2 oluline TNBC rakkude kasvu säilitamiseks ja vähendab metüleeritud transkriptide hulka kõrgetasemelise transkriptsiooni ja translatsiooni ajal vähirakkudes, millel on kõrgem MYC ekspressioon. Lisaks ei ole YTHDF2 vähirakkude jaoks hädavajalik, mis on TNBC patsientide elulemuse pikendamiseks vähem sõltuvad kõrgenenud MYC tasemetest (Einstein jt, 2021), mis viitab sellele, et see võib olla potentsiaalne terapeutiline sihtmärk ravimitele, mis suudavad TNBC-st üle saada.
Tsink-sõrme valgud (ZNF-id) moodustavad ligikaudu 1% kogu inimese genoomist. Uuringud on näidanud, et ZNF suudab reguleerida rakkude proliferatsiooni erinevates vähivormides, näiteks maksavähis, rinnavähis ja kolorektaalvähis (Zhang W. jt, 2021; Li jt, 2017). CRISPR-i väljalülitusega loodud teeke on kasutatud erinevate kasvaja supressorgeenide (TSG-de) skriinimiseks rinnavähirakkudes (Shalem jt, 2014). Sellest ajast alates on CRISPR/Cas9 ZNF319-deletsiooniga rinnavähirakkude transkriptoomiline uuring näidanud, et ZNF319 on kasvaja supressorgeen, mis vähendab rinnavähi proliferatsiooni ja on seetõttu seotud mitmesuguste potentsiaalsete signaalimehhanismide ja muude bioloogiliste funktsioonidega (Wang L. jt, 2022).
Ferroptoos on programmeeritud rakusurma tüüp, mis sõltub raua olemasolust. On teada, et ferroptoosi arengut mõjutab lipiidperoksiidide olemasolu. Lisaks on teatatud, et PKCβII-l on varajane lipiidide peroksüdatsioon ja suurenenud lipiidide peroksüdatsioon on seotud ferroptoosiga. CRISPR/Cas9-vahendatud kinaasi inhibiitorite teeki skriining näitas, et PKCβII osaleb lipiidide peroksüdatsiooni protsessis, mis on MDA-MB-231 rakkude ferroptoosi jaoks kriitilise tähtsusega (Zhang jt, 2022). Seega viitab see sellele, et PKCβII väljalülitamine CRISPR/Cas9 poolt võib olla potentsiaalne kasvaja supressorgeeni sihtmärk ferroptoosiga seotud haiguste ravis (Zhang jt, 2022).
Arvatakse, et ravimiresistentsus põhjustab ligikaudu 90% vähihaigete surmadest ja on üks peamisi väljakutseid vähiravis (Bukowski jt, 2020). Tulemused näitavad, et ravimiresistentsusega on seotud piisav arv geene, mis on seotud ravimite väljavoolu, DNA parandamise, apoptoosi ja erinevate raku signaaliülekande radadega (Haider jt, 2020). Nende hulgas on CRISPR/Cas9 tööriistad sihikule võtnud mitmeid geene ja need on näidanud paljulubavaid tulemusi ravimiresistentsuse vähendamisel ja vähivastaste ravimite efektiivsuse suurendamisel (Vaghari-Tabari jt, 2022). Lisaks on suure läbilaskevõimega CRISPR/Cas9 geeni väljalülitamise sõeluuringute teeke seostatud potentsiaalsete ravimiresistentsuse geenide sihtmärkide funktsiooni muutmisega (Shalem jt, 2015). Paklitakseeli resistentsusgeenide tuvastamiseks kasutati RNA sekveneerimist koos genoomiülese sgRNA teekide sõeluuringuga, et tuvastada kaheksa kandidaatgeeni, sealhulgas histoon deatsetülaas 9 (HDAC9), mis on seotud ravimiresistentsusega korduva TNBC-ga patsientidel (B jt, 2020). Teises uuringus täheldati vähivastaste ravimitega ravitud TNBC patsientide ellujäämise ajal diseriini/treoniini ja türosiinproteiinkinaasi (DSTYK) suurenenud ekspressiooni. Lisaks suurendas CRISPR/Cas9-vahendatud DSTYK vaigistamine oluliselt ravimiresistentsete vähirakkude apoptoosi in vitro (SUM102PT rakud ja MDA-MB-468 rakud) ja in vivo TNBC mudelis (Ogbu jt, 2021).
Kuigi TNBC-l on MAPK raja ebanormaalne aktivatsioon, on MEK-sihitud ravi kliiniline efekt nõrk. CRISPR/Cas9 genoomse teeki skriining näitas, et PSMG2 (proteoomi assamblee šaperon 2) inhibeerimine sensibiliseerib TNBC BT549 ja MB468 rakke MEK inhibiitori AZD6244 suhtes. PSMG2 pärssimine CRISPR/Cas9 poolt muutis proteasoomi normaalset funktsiooni, mis viis autofaagia vahendatud PDPK1 lahtivõtmiseni, parandades seeläbi veelgi kasvajarakke TNBC hiiremudelites, mida indutseerisid AZD6244 (MEK inhibiitor) ja MG132 (proteasoomi inhibiitor). Seega saab proteasoomi ja MAP kinaasi (MEK) inhibiitoreid manustada sünergiliselt, et vähendada kasvajarakkude proliferatsiooni (Wang X. jt, 2022).
CRISPR/Cas9 on kasutatud ka TNBC resistentsusele viiva geenifunktsiooni kadumise skriinimiseks (Shu jt, 2020). Ge jt selgitasid BET-bromodomeeni inhibiitori (BBDI) JQ1-ga töödeldud vähirakkude ravimiresistentsuse mehhanismi TNBC-s. CRISPR/Cas9 abil leidsid nad, et rb1 geeni deletsioon põhjustas TNBC resistentsuse vähivastase ravimi JQ1 suhtes. Seetõttu on rb1 funktsioon oluline JQ1 ravimitele reageerimisel TNBC-s. Samuti teatasid nad, et paklitakseel on CDK4/6 kinaasi/mikrotuubulite inhibiitor ja selle kombinatsioon BBDI-dega, näiteks JQ1-ga, võib pakkuda paljulubavaid terapeutilisi vastuseid ravimiresistentsete TNBC-de korral (Ge jt, 2020).
On teatatud, et pika mittekodeeriva RNA (lncRNA) transkriptsioonimaastik vastutab TNBC-s neoadjuvantravi resistentsuse eest. See uuring näitab, et TNBC-s ekspresseeruvad kõrgelt viis erinevat MALAT1 lncRNA transkripti. Lisaks suurendas CRISPR/Cas9-vahendatud MALAT1 deletsioon TNBC BT-549 rakkude tundlikkust paklitakseeli ja doksorubitsiini suhtes, mis viitab MALAT1 resistentsuse potentsiaalsele rollile TNBC-s (Shaath jt, 2021).
BRCA1 (BRCA1m) mutatsioonid on heterogeensed ja seetõttu raskesti tuvastatavad. PARP1 (polü(ADP-riboos) polümeraas), BRCA1 sünteetilise letaalse partneri, sihtimine võib suurendada TNBC ravimite kemotundlikkust. CRISPR/Cas9 abil suurendas PARP1 deletsioon vähivastaste ravimite, näiteks doksorubitsiini, gemtsitabiini ja dotsetakseeli, tundlikkust mBRCA1 mutantsete TNBC rakkude suhtes, mis viitab sellele, et PARP1 osaleb ka ravimiresistentsuses TNBC-s (Vaghari-Tabari jt, 2022). On teada, et mutatsioonid kasvaja supressorgeenides BRCA1 või BRCA2 suurendavad rinnavähi tekke tõenäosust inimestel. Nende patsientide ravi nõuab PARP inhibiitorite kasutamist. Lisaks on näidatud, et nukleotiidi päästefaktori DNPH1 väljalülitamine CRISPR/Cas9 abil võib eemaldada toksilise nukleotiidi 5-hüdroksümetüüldeoksüuridiin (hmdU) monofosfaadi, suurendades seeläbi BRCA-defitsiitsete rakkude vastust PARP inhibiitorite tundlikkusele (Fugger jt, 2021). Seega võivad CRISPR/Cas9 ja PARP1 inhibiitorid muutuda oluliseks TNBC ravistrateegiaks.
Penetrantse glükoproteiini (P-gp) geen on multiravimiresistentsuse geen, mis on üldiselt ülesreguleeritud ligikaudu 41%-l kõigist TNBC-dest (Sun jt, 2020). P-gp-indutseeritud ravimite väljavool on tuvastatud kui ravimiresistentsuse peamine regulaator rinnavähi korral. P-gp inhibiitorid on näidanud suurenenud tundlikkust vähivastaste ravimite suhtes rinnavähi korral (Famta jt, 2021). Seega võivad CRISPR/Cas9-vahendatud P-gp ja P-gp inhibiitorite ablatsioon või supressioon olla väga olulised meetodid ravimiresistentsuse ületamiseks TNBC-s.
ATP-siduv kassetttransporter G2 (ABCG2) on teadaolevalt põhjustanud ravimiresistentsust TNBC-s (Palasuberniam jt, 2015), kuigi praegu puuduvad aruanded CRISPR/Cas9 ja ABCG2 vaigistamise ning kasvaja supressorgeeni inaktiveerimise vahelise seose kohta. PTEN võib suurendada ABCG2 aktivatsiooni (Palasuberniam jt, 2015), (Deepak Singh jt, 2021). Seetõttu võib CRISP/Ca9 kasutamine ABCG2 eemaldamiseks ja selle kombineerimine ABCG2 inhibiitoriga olla sobiv ravi ravimiresistentsuse ületamiseks TNBC-s. Tabelis 2 on mainitud CRISPR/Cas9, mis on suunatud kõigile resistentsusgeenidele.
Tabel 2. CRISPR/Cas9 sihib erinevaid TNBC resistentsusgeene, et muuta rakud vähivastaste ravimite suhtes tundlikumaks.
CRISPR/Cas9 teegid on potentsiaalsed vahendid vähi patogeneesiga seotud geenimutatsioonide skriinimiseks (Chan jt, 2022). See sõelumismeetod hõlmab nelja etappi: (a) teegi loomine, (b) lentiviiruse transduktsioon, (c) fenotüübiline skriining ja (d) sihtgeeni analüüs. Kuigi TNBC-l on MAPK raja ebanormaalne aktivatsioon, on MEK-sihipärase ravi kliiniline prognoos TNBC patsientidel, kellel on mutatsioonid kasvaja supressorgeenides nagu PTEN, RB1 ja TP53, väga halb.
Lisaks testiti CRISPR/Cas9 abil geeni väljalülitamise sõeluuringul kõige tugevamat ja selektiivsemat molekuli, dehüdrokatrooli, mida leidub ohtralt Guatemala õie- ja leheekstraktides, et mõista dehüdrokatrooli mõju MDA-MB-231-le. Selektiivse raku tsütotoksilisuse mehhanismid. TNBC alatüüpide mesenhümaalse tüve omadused. See CRISPR/Cas9-põhine sõeluuring näitas ka, et HSD17B11, 17β-hüdroksüsteroiddehüdrogenaasi tüüpi 11 kodeeriv geen, ekspresseerub MDA-MB-231 rakkudes kõrgelt ja annab tulemuseks MDA-MB-231 rakkudele spetsiifilise dehüdrofalkarinooli (Grant jt, 2020). Seega viitab see sellele, et CRISPR/Cas9 genoomsel sõelumisel on suur potentsiaal potentsiaalsete looduslike ühendite vähivastaste omaduste aluseks olevate mehhanismide tuvastamisel.
Lisaks uuriti TNBC haavatavust vähi suhtes erapooletu genoomiülese in vivo CRISPR/Cas9 skriinimise abil, mis näitas seost onkogeensete ja kasvaja supressorradade vahel. On teatatud, et mTOR ja Hippo radade põhikomponentidel on oluline roll kasvaja regulatsioonis TNBC-s. Lisaks on uuringud näidanud, et mTORC1/2 ja YAP onkoproteiini farmakoloogiline pärssimine pärsib tõhusalt TNBC patogeneesi, kasutades in vitro ravimi-maatriksi sünergia mudelit ja patsientidelt saadud in vivo ksenotransplantaate. Lisaks suurendab Torin-1 vahendatud mTORC1/2 pärssimine makropinotsütoosi, samas kui verteporfiini poolt indutseeritud YAP pärssimine viib TNBC rakkude surmani. Kokkuvõttes rõhutavad need tulemused genoomiülese in vivo CRISPR-skriiningu võimsust ja tugevust TNBC uute ja tõhusate ravimeetodite tuvastamisel (Dai jt, 2021).
Immuunsüsteemi düsregulatsioon on oluline tegur kasvaja tekkes. Vähirakud väldivad immuunsüsteemi eliminatsiooni, möödudes kaitsemehhanismidest, sealhulgas häirides immuunrakkude aktiivsust kasvaja mikrokeskkonnas ja kahjustades immuunsüsteemi. Seetõttu võib parendatud immuunsüsteemi väljatöötamine olla võtmetähtsusega lähenemisviis kasvajate vastu võitlemisel. CRISPR/Cas9-põhise geenimodifikatsiooni kasutamine käsitleb mitmeid immuunfunktsiooni häiretega seotud probleeme erinevatest vaatenurkadest. CRISPR/Cas9 on kasutatud rinnavähivastase immuunsuse parandamiseks järgmiste radade kaudu (joonis 3).
Joonis 3. CRISPR/Cas9 immunoteraapia on suunatud TNBC rakkudele. CDK5 kadumine ning PDL1 ja CD155 vaigistamine tugevdavad immuunsüsteemi. Samamoodi suurendasid A2AR kadumine ja TAA-de, näiteks HER2, mutsiin 1 ja TEM8 vaigistamine CAR-T-rakkude efektiivsust vähirakkude hävitamisel. CRISPR/Cas9-põhine T-rakkude skriining on näidanud, et p38 kinaasi häirimine suurendab T-rakkude kasvajavastast aktiivsust. CRISPR/Cas9 poolt modifitseeritud T-rakud suurendavad TCR-i (T-raku retseptori) ekspressiooni, mille tulemuseks on T-rakkude kasvajavastane toime.
Immunoteraapia eesmärk on stimuleerida immuunsüsteemi ründama vähirakke. Immuunsüsteemi kontrollpunkti valkude üleekspressioon ennetab tavaliselt autoimmuunreaktsioone, kuid võib aidata vähirakkudel neid vältida (Topalian jt, 2015). Need valgud ennetavad immuunreaktsioone, seondudes immuunrakkude pinnal olevate retseptoritega. Mitmed kontrollpunkti valgud (näiteks CD155 ja PD-L1) on suunatud immuunrakkudel olevatele PD-1 retseptoritele ja neid ekspresseeritakse rinnavähis, eriti TNBC-s (Li Y.-C. jt, 2020). PD-L1 või selle retseptori pärssimine CRISPR/Cas9 abil võib stimuleerida immuunsüsteemi ründama TNBC kasvajaid (Yahata jt, 2019). Lisaks on näidatud, et PD-L1 ekspressiooni allareguleerimine CRISPR/Cas9 vahendatud CDK5 deletsiooni kaudu pärsib kasvajate kasvu nii in vitro kui ka in vivo (Deng jt, 2020). Rinnavähi kasvu pärssimine in vitro ja in vivo mudelites viitab sellele, et shRNA-vahendatud CD155 redutseerimisel võib olla rinnavähile terapeutiline toime (Gao jt, 2018).
CAR T-rakud ekspresseerivad CAR-e, mis tunnevad ära kasvajaga seotud antigeene (TAA-sid) ja saavad kontrollpunkti valkude vaigistamist kasutada oma aktiivsuse suurendamiseks (Li C. jt, 2020). CAR T-rakkude teraapias rinnavähi korral on mitmeid potentsiaalseid sihtmärke, sealhulgas mitu TAA-d, näiteks HER2, mutsiin 1 ja TEM8 (Bajgain jt, 2018). On tõendeid, et mesoteliini (üleekspresseeritud TNBC BT-459 rakkudes) sihtivad CAR T-rakud on vähi vastu tõhusamad, kui PD-1 CRISPR/Cas9 abil välja lülitatakse (Hu jt, 2019). T-rakkude eraldamine patsientidelt ja seejärel nende ex vivo redigeerimine on aga töömahukas ja aeganõudev protsess. Kuigi universaalsed T-rakud võivad vähendada eraldamisnõudeid, tuleks inimese leukotsüütide antigeeni (HLA) I klassi ja T-rakkude retseptorit (TCR) ekspresseerivad doonor-T-rakud eemaldada, et vältida transplantaadi ja peremehe vastast reaktsiooni (Ren jt, 2017, 2017a). Kasutades CRISPR/Cas9, saab HDR samaaegselt elimineerida TCR-i ja HLA ning välja lülitada CAR-i kodeeriva geeni. Uuringud on näidanud, et CRISPR/Cas9 abil saab sisestada TCR-i lookusesse anti-CD19 CAR-e, tootes seeläbi CAR-e tõhusalt ilma T-rakke ammendamata (Dimitri jt, 2022). Multiplekstehnoloogiaid on välja töötatud allogeensete CAR T-rakkude genereerimiseks, elimineerides samaaegselt TCR-i, beeta-2-mikroglobuliini (B2M), HLA-I subühiku ja teisi valke, näiteks PD-1 ja CTLA-4, millel võivad olla suuremad vähivastased omadused TNBC vastu (Eyquem jt, 2017; Liu jt, 2017; Ren jt, 2017b; Dimitri jt, 2022).
CRISPR/Cas9 kasutamine võib parandada CAR-T-rakkude efektiivsust. Adenosiin omab teadaolevalt immunosupressiivseid omadusi ja võib vähendada vähivastast immuunsust, blokeerides T-rakkude funktsiooni ja aktiveerides adenosiini A2A retseptoreid (A2AR) (Vigano jt, 2019). A2AR-i vaigistamine CRISPR/Cas9 abil parandas oluliselt CAR-T-rakkude efektiivsust in vivo (Giuffrida jt, 2021). T-rakkudel on teadaolevalt mitmesugused fenotüüpilised omadused, nagu rakkude laienemine, diferentseerumine, oksüdatiivne stress ja genoomne stress. CRISPR/Cas9-põhine T-rakkude skriining näitas 25 erineva T-raku retseptori kinaasi häirimist. Nende hulgas on näidatud, et p38 kinaasi deletsioon suurendab T-rakkude kasvajavastast aktiivsust, mis näitab, et p38 kinaas on CAR-T-rakkude regulatsiooni peamine regulaator (Gurusamy jt, 2020).
T-rakke saab geneetiliselt modifitseerida CRISPR/Cas9 abil, et toota kõrge ekspressiooniga T-rakke. Geneetiliselt muundatud T-rakkude ülekandmine patsientidele on näidanud tugevamat vähivastast aktiivsust kui endogeensed T-rakud. Seetõttu võivad endogeensed T-rakud patsientidel konkureerida geneetiliselt muundatud T-rakkudega, mis võib mõjutada vähi immunoteraapia potentsiaali. Selle probleemi lahendamiseks võib CRISPR/Cas9 kasutamine endogeense TCR-β eemaldamiseks retsipientrakkudest ja seejärel TCR-β T-rakkude ülekandmine vähihaigetele avaldada paremaid vähivastaseid immuunvastuseid ilma endogeensete TCR-ide seksuaalse konkurentsi vajaduseta (Fan jt 2018). Seega, välja arvatud CRISPR-modifitseeritud T-rakud, on TCR-id tuhat korda tundlikumad kasvaja antigeenide suhtes kui normaalsed TCR-transdutseeritud T-rakud. Lisaks näitavad γδ TCR+ CRISPR-i poolt genereeritud muudetud T-rakud erinevate leukeemiate korral CD4+ ja CD8+ T-rakkude kõrgemat ekspressiooni kui standardne TCR-i ülekanne (Legut jt, 2018). Seega võivad CRISPR/Cas9 abil genereeritud modifitseeritud T-rakud olla tõhus immunoteraapia meetod TNBC ületamiseks.
Integriinid on rakkude adhesioonimolekulid, mis esinevad rakkude transmembraanides ja soodustavad rakkude seondumist rakuvälise maatriksiga (ECM) (Hamidi ja Ivaska, 2018). Integriinide düsregulatsioon on seotud vähi arengu ja migratsiooniga, muutes rakuvälist maatriksit, mis viib vähirakkude ellujäämiseni vereringes (Hamidi ja Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-vahendatud integriini vaigistamine aeglustab kasvaja progresseerumist, metastaase ja koloniseerimist TNBC-s. Integriini α5 (ITGA5) vaigistamise kohta on teatatud, et see vähendab rakkude migratsiooni ja progresseerumist ka teistes vähivormides, näiteks kopsuvähis (Ju jt, 2017), mis viitab sellele, et integriin α5 võib olla ka TNBC patogeneesi võtmetegur.
Traditsiooniliste embrüonaalsete tüvirakkude (ES) meetodite abil knockout-hiirte genereerimine on töömahukas, aeganõudev ja ebaefektiivne protsess. ES-rakkude sihtimine homoloogse rekombinatsiooni abil, kimäärsete hiirte aretamine ja seejärel nende ristamine heterosügootsete hiirtega homosügootsete järglaste saamiseks võtab kuid ja aastaid. Mitme geneetilise mutatsiooniga hiirte loomiseks on vaja keerulist ristamist. Siiski on CRISPR/Cas9 abil ES-rakkude ablatsiooni või CRISPR/Cas9 komponentide mikroinjektsiooni teel üherakulistesse viljastatud munarakkudesse genereeritud hiirte kasutamisel tekkinud palju probleeme. Näiteks toimub muutuste sissetoomine sageli bialleelsetes lookustes ja ei ole geenispetsiifiline. Hiljuti teatati, et CRISPR/Cas9 tehnoloogiat kasutavad ES-rakud suudavad samaaegselt sisestada bialleelseid mutatsioone kuni 5 geeni (Nishizono jt, 2021). Sel eesmärgil transfekteeriti ES-rakkudesse samaaegselt Cas9 mRNA ja viis geenispetsiifilist gRNA-d. See rõhutab selle protseduuri paljutõotavust ja tõhusust, kuigi need mutatsioonid võidi edasi kanda, kui asutajaliine aretati viiekordsete knockout-hiirte saamiseks. Uuring teatab ka üllatavast avastusest: ES-rakke ei ole enam vaja geneetiliselt muundatud hiirte loomiseks. Selle asemel süstiti spetsiifiliste geeniproduktide eemaldamiseks üherakulise staadiumi embrüotesse Cas9 mRNA ja gRNA. Selle tulemusena loodi knockout-asutajaliinid, mida saab teoreetiliselt kasutada geenide deletsiooni tagajärgede uurimiseks hiirtel (Qin jt, 2016). Seega võimaldab CRISPR/Cas9 luua transgeenseid hiiri TNBC raviks odavamalt kui traditsiooniline geenitehnoloogia. CRISPR/Cas süsteemi abil on välja töötatud uus knockout-hiiremudel, mis suudab edukalt sisse viia punktmutatsioone ühte või mitmesse TNBC endogeensesse geeni. Selle kontseptsiooni põhjal saab TNBC loommudeleid välja töötada ka CRISPR/Cas9-vahendatud BRCA1 ja p53 deletsiooni abil, mille tulemuseks on HR-i parandamise kadu, genoomne ebastabiilsus ja mutantsed fenotüübid (Annunziato jt, 2020).
Praegu kasutatakse TNBC diagnoosimiseks mitmesuguseid meetodeid, nagu mammograafia, magnetresonantstomograafia (MRI) ja ultraheli. Neil meetoditel on aga mõned piirangud. Mammograafiat kasutatakse pigem lokaalse rinnakoe diagnoosimiseks kui metastaaside diagnoosimiseks, kus vähirakud on migreerunud teistesse organitesse. Ultraheli ei ole TNBC diagnoosimiseks usaldusväärne meetod (Chen ja Lee-Felker, 2023). MRI-l on suurem tundlikkus kui ultrahelil ja mammograafial, kuid selle diagnostiline täpsus on piiratud (Sha ja Chen, 2022). Koebiopsia on invasiivne viis vähirakkude tuvastamiseks. Mõnel juhul võib biopsia aga vähikude märkamata jätta, kui nõel kaldub huvipakkuvast piirkonnast eemale. Lisaks on see väga kallis ja patsiendile traumaatiline. TNBC on heterogeenne vähiliik, seega ei pruugi biopsia anda piisavalt teavet vähitüübi kohta. Seetõttu on hädasti vaja uut diagnostiliselt usaldusväärset meetodit TNBC tuvastamiseks. CRISPR/Cas9 võib olla rinnavähi diagnoosimisel väga tundlik ja minimaalselt invasiivne alternatiiv. Sel eesmärgil saab CRISPR/Cas9-põhiseid strateegiaid kasutada TNBC diagnoosimise PCR-meetodite täiustamiseks. Esiteks kasutatakse CRISPR-süsteemi Cas9 ja cpf1 valke mittespetsiifilise DNA eemaldamiseks ning seejärel suudavad need kaks valku (Cas9 ja cpf1) enne siht-DNA-ga seondumist ära tunda PAM-järjestuse (Deepak Singh jt, 2021). Seega saab PCR-i abil tuvastada vähi tekkega seotud mutatsioone. Mitmed uuringud on kasutanud seda CRISPR-põhist strateegiat erinevate mutatsioonide tuvastamiseks erinevates vähivormides (Safari jt, 2019). Seega võivad CRISPR-põhised PCR-meetodid vähendada TNBC diagnoosimise sõltuvust invasiivsetest meetoditest, näiteks biopsial põhinevast immunohistokeemiast.
Hormoonretseptori regulatsiooni genotüübilisi muutusi on näidatud ka TNBC-s (Chen ja Russo, 2009). CRISPR/Cas9-põhised PCR-strateegiad, mis kasutavad mikrokiipe ravikoha diagnostikaks, võimaldavad neid mutatsioone tõhusalt jälgida (Hajian jt, 2019). See võib anda tervishoiuteenuse osutajatele ka asjakohast teavet TNBC patsientide spetsiifiliste mutatsioonide kohta, mis võib aidata parandada nende ravikuuri. Sellel kombineeritud tehnikal on aga piirangud. Seetõttu on enne selle CRISPR/Cas-PCR meetodi kasutamist tervishoius TNBC diagnoosimiseks vaja ulatuslikke uuringuid (Yang jt, 2019).
Postituse aeg: 14. okt 2024