Kliinilises praktikas on endiselt väljakutseks kompuutertomograafia (CT) abil tuvastatud kopsusõlmede diferentsiaaldiagnostika.Siin kirjeldame 480 seerumiproovi globaalset metaboloomi, sealhulgas terved kontrollid, healoomulised kopsusõlmed ja I staadiumi kopsu adenokartsinoom.Adenokartsinoomidel on ainulaadsed metaboolsed profiilid, samas kui healoomulistel sõlmedel ja tervetel inimestel on metaboolsete profiilide osas suur sarnasus.Avastusrühmas (n = 306) tuvastati healoomuliste ja pahaloomuliste sõlmede eristamiseks 27 metaboliiti.Diskrimineeriva mudeli AUC sisemise valideerimise (n = 104) ja välise valideerimise (n = 111) rühmas oli vastavalt 0,915 ja 0,945.Raja analüüs näitas glükolüütiliste metaboliitide suurenemist, mis on seotud trüptofaani vähenemisega kopsu adenokartsinoomi seerumis, võrreldes healoomuliste sõlmede ja tervete kontrollidega, ning näitas, et trüptofaani omastamine soodustab glükolüüsi kopsuvähirakkudes.Meie uuring toob esile seerumi metaboliitide biomarkerite väärtuse CT-ga tuvastatud kopsusõlmede riski hindamisel.
Varajane diagnoosimine on vähihaigete elulemuse parandamiseks ülioluline.USA riikliku kopsuvähi sõeluuringu (NLST) ja Euroopa NELSONi uuringu tulemused on näidanud, et madala doosiga kompuutertomograafia (LDCT) skriinimine võib oluliselt vähendada kopsuvähi suremust kõrge riskiga rühmades1,2,3.Alates LDCT laialdasest kasutamisest kopsuvähi sõeluuringus on juhuslike asümptomaatiliste kopsusõlmede radiograafiliste leidude esinemissagedus jätkuvalt suurenenud 4 .Kopsusõlmed on defineeritud kui fookuskaugused läbimõõduga kuni 3 cm 5 .Meil on raskusi pahaloomulise kasvaja tõenäosuse hindamisel ja LDCT-ga juhuslikult tuvastatud suure hulga kopsusõlmede käsitlemisel.CT piirangud võivad viia sagedaste järelkontrollideni ja valepositiivsete tulemusteni, mis toob kaasa tarbetu sekkumise ja üleravi6.Seetõttu on vaja välja töötada usaldusväärsed ja kasulikud biomarkerid, et õigesti tuvastada kopsuvähk varajases staadiumis ja eristada enamikku healoomulistest sõlmedest esialgsel avastamisel 7 .
Vere (seerumi, plasma, perifeerse vere mononukleaarsete rakkude) põhjalik molekulaarne analüüs, sealhulgas genoomika, proteoomika või DNA metüülimine 8, 9, 10, on suurendanud huvi kopsuvähi diagnostiliste biomarkerite avastamise vastu.Vahepeal mõõdavad metaboolsed lähenemisviisid rakulisi lõpptooteid, mida mõjutavad endogeensed ja eksogeensed toimingud ning mida seetõttu kasutatakse haiguse alguse ja tulemuste ennustamiseks.Vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetria (LC-MS) on oma suure tundlikkuse ja suure dünaamilise ulatuse tõttu laialdaselt kasutatav meetod metaboolsete uuringute jaoks, mis võib hõlmata erinevate füüsikalis-keemiliste omadustega metaboliite11,12,13.Kuigi kopsuvähi diagnoosimise 14, 15, 16, 17 ja ravi efektiivsusega seotud biomarkerite tuvastamiseks on kasutatud plasma / seerumi globaalset metaboolset analüüsi, tuleb veel palju uurida seerumi metaboliitide klassifikaatoreid healoomuliste ja pahaloomuliste kopsusõlmede eristamiseks.- massiivsed uuringud.
Adenokartsinoom ja lamerakuline kartsinoom on mitteväikerakk-kopsuvähi (NSCLC) kaks peamist alatüüpi.Erinevad CT-sõeluuringud näitavad, et adenokartsinoom on kõige levinum kopsuvähi histoloogiline tüüp1,19,20,21.Selles uuringus kasutasime üliefektiivset vedelikkromatograafiat-kõrge eraldusvõimega massispektromeetriat (UPLC-HRMS), et teha metaboolne analüüs kokku 695 seerumiprooviga, sealhulgas terved kontrollid, healoomulised kopsusõlmed ja CT-ga tuvastatud ≤3 cm.I staadiumi kopsu adenokartsinoomi sõeluuring.Tuvastasime seerumi metaboliitide paneeli, mis eristab kopsu adenokartsinoomi healoomulistest sõlmedest ja tervetest kontrollidest.Raja rikastamise analüüs näitas, et ebanormaalne trüptofaani ja glükoosi metabolism on kopsu adenokartsinoomi tavalised muutused võrreldes healoomuliste sõlmede ja tervete kontrollidega.Lõpuks kehtestasime ja valideerisime kõrge spetsiifilisuse ja tundlikkusega seerumi metaboolse klassifikaatori, et eristada LDCT-ga tuvastatud pahaloomulisi ja healoomulisi kopsusõlmesid, mis võib aidata varakult diferentsiaaldiagnostikat ja riskianalüüsi.
Käesolevas uuringus koguti soo ja vanusega sobitatud seerumiproovid tagasiulatuvalt 174 tervelt kontrollilt, 292 healoomuliste kopsusõlmedega patsiendilt ja 229 patsiendilt, kellel oli I staadiumi kopsu adenokartsinoomi.695 katsealuse demograafilised omadused on näidatud täiendavas tabelis 1.
Nagu on näidatud joonisel 1a, koguti Sun Yat-seni ülikooli vähikeskuses kokku 480 seerumiproovi, sealhulgas 174 tervet kontrolli (HC), 170 healoomulist sõlme (BN) ja 136 I staadiumi kopsu adenokartsinoomi (LA) proovi.Avastusrühm sihipärase metaboolse profiili koostamiseks, kasutades üliefektiivset vedelikkromatograafiat-kõrge eraldusvõimega massispektromeetriat (UPLC-HRMS).Nagu on näidatud lisajoonisel 1, tuvastati LA ja HC, LA ja BN vahelised erinevad metaboliidid, et luua klassifitseerimismudel ja uurida edasi diferentsiaalraja analüüsi.Sun Yat-seni ülikooli vähikeskuse kogutud 104 proovi ja kahe teise haigla kogutud 111 proovi allutati vastavalt sisemisele ja välisele valideerimisele.
Uuringupopulatsioon avastusrühmas, mis läbis globaalse seerumi metaboolse analüüsi, kasutades üliefektiivset vedelikkromatograafiat ja kõrge eraldusvõimega massispektromeetriat (UPLC-HRMS).b Osaline vähimruutude diskrimineerimisanalüüs (PLS-DA) kogu metaboloomi kohta 480 seerumiproovist uuringurühmast, sealhulgas terved kontrollid (HC, n = 174), healoomulised sõlmed (BN, n = 170) ja I staadiumi kopsu adenokartsinoom (Los Angeles, n = 136).+ESI, positiivne elektropihustusionisatsiooni režiim, -ESI, negatiivne elektropihustusionisatsiooni režiim.c–e Metaboliidid, mille arvukus on kahes antud rühmas oluliselt erinev (kahe sabaga Wilcoxoni märgistatud järjestuse test, vale avastamise määraga korrigeeritud p väärtus, FDR <0,05) on näidatud punase (kordne muutus > 1,2) ja sinisena (kordne muutus < 0,83) .) näidatud vulkaani graafikul.f Hierarhiline klastrite soojuskaart, mis näitab olulisi erinevusi annoteeritud metaboliitide arvus LA ja BN vahel.Lähteandmed esitatakse lähteandmete failide kujul.
Seerumi 174 HC, 170 BN ja 136 LA metaboolset kogust avastusrühmas analüüsiti UPLC-HRMS analüüsi abil.Esiteks näitame, et kvaliteedikontrolli (QC) proovid koonduvad tihedalt järelevalveta põhikomponentide analüüsi (PCA) mudeli keskele, kinnitades praeguse uuringu toimivuse stabiilsust (täiendav joonis 2).
Nagu on näidatud joonisel 1b näidatud osalise vähimruutude diskrimineerimisanalüüsis (PLS-DA), leidsime, et positiivsetes (+ESI) ja negatiivsetes (-ESI) elektropihustusionisatsioonirežiimides on LA ja BN, LA ja HC vahel selged erinevused. .isoleeritud.Siiski ei leitud olulisi erinevusi BN ja HC vahel +ESI ja -ESI tingimustes.
Leidsime 382 erinevust LA ja HC vahel, 231 erinevust LA ja BN vahel ning 95 diferentsiaaltunnust BN ja HC vahel (Wilcoxoni märgiga auaste test, FDR <0,05 ja mitmekordne muutus >1,2 või <0,83) (joonis .1c-e )..Lisaks märgiti piigid (täiendavad andmed 3) võrreldes andmebaasiga (mzCloud/HMDB/Chemspider raamatukogu) m/z väärtuse, retentsiooniaja ja killustumise massispektri otsinguga (üksikasjad on kirjeldatud jaotises Meetodid) 22 .Lõpuks tuvastati LA versus BN (joonis 1f ja täiendav tabel 2) ja LA versus HC (täiendav joonis 3 ja täiendav tabel 2) puhul vastavalt 33 ja 38 annoteeritud metaboliiti, mille arvukuse erinevused olid olulised.Seevastu BN-s ja HC-s tuvastati ainult 3 metaboliiti, mille arvukus oli oluline (täiendav tabel 2), mis on kooskõlas BN-i ja HC kattumisega PLS-DA-s.Need erinevad metaboliidid hõlmavad suurt hulka biokemikaale (täiendav joonis 4).Kokkuvõttes näitavad need tulemused olulisi muutusi seerumi ainevahetuses, mis peegeldavad varajases staadiumis kopsuvähi pahaloomulist transformatsiooni võrreldes healoomuliste kopsusõlmede või tervete isikutega.Samal ajal viitab BN ja HC seerumi metaboloomi sarnasus sellele, et healoomulistel kopsusõlmedel võib tervetel inimestel olla palju bioloogilisi omadusi.Arvestades, et epidermaalse kasvufaktori retseptori (EGFR) geenimutatsioonid on kopsu adenokartsinoomi alatüübis 23 tavalised, püüdsime kindlaks teha draiveri mutatsioonide mõju seerumi metaboolsele.Seejärel analüüsisime 72 EGFR-i staatusega juhtumi üldist metaboolset profiili kopsu adenokartsinoomi rühmas.Huvitaval kombel leidsime PCA analüüsis võrreldavad profiilid EGFR-i mutantsete patsientide (n = 41) ja EGFR-i metsiktüüpi patsientide (n = 31) vahel (täiendav joonis 5a).Siiski tuvastasime 7 metaboliiti, mille arvukus oli EGFR-i mutatsiooniga patsientidel oluliselt muutunud võrreldes metsiktüüpi EGFR-iga patsientidega (t-test, p <0, 05 ja kordne muutus> 1, 2 või < 0, 83) (täiendav joonis 5b).Enamik neist metaboliitidest (5 7-st) on atsüülkarnitiinid, mis mängivad olulist rolli rasvhapete oksüdatsiooniradadel.
Nagu on näidatud joonisel 2a näidatud töövoos, saadi sõlmede klassifitseerimise biomarkerid, kasutades vähima absoluutse kokkutõmbumise operaatoreid ja valikut, mis põhines 33 erineval metaboliidil, mis tuvastati LA (n = 136) ja BN (n = 170).Parim muutujate kombinatsioon (LASSO) – binaarne logistiline regressioonimudel.Mudeli usaldusväärsuse testimiseks kasutati kümnekordset ristvalideerimist.Muutujate valikut ja parameetrite reguleerimist reguleeritakse tõenäosuse maksimeerimise trahviga parameetriga λ24.Globaalne metaboolne analüüs viidi täiendavalt läbi iseseisvalt sisemise valideerimise (n = 104) ja välise valideerimise (n = 111) rühmades, et testida diskrimineeriva mudeli klassifitseerimise toimivust.Selle tulemusena identifitseeriti 27 metaboliiti avastuskomplektis kui parimat diskrimineerivat mudelit, millel on suurim keskmine AUC väärtus (joonis 2b), millest 9 oli suurenenud aktiivsusega ja 18 vähenenud aktiivsus LA-s võrreldes BN-ga (joonis 2c).
Kopsusõlmede klassifikaatori koostamise töövoog, sealhulgas parima seerumi metaboliitide paneeli valimine avastuskomplektist, kasutades binaarset logistilist regressioonimudelit kümnekordse ristvalideerimise teel ning sisemiste ja väliste valideerimiskomplektide ennustava toimivuse hindamist.b LASSO regressioonimudeli ristvalideerimise statistika metaboolsete biomarkerite valiku jaoks.Ülaltoodud numbrid tähistavad antud λ juures valitud biomarkerite keskmist arvu.Punane punktiirjoon tähistab keskmist AUC väärtust vastava lambda juures.Hallid vearibad tähistavad minimaalset ja maksimaalset AUC väärtust.Punktiirjoon tähistab parimat mudelit 27 valitud biomarkeriga.AUC, vastuvõtja tööomaduste (ROC) kõvera alune pindala.c LA rühma 27 valitud metaboliidi muutused võrreldes BN-rühmaga avastusrühmas.Punane veerg – aktiveerimine.Sinine veerg on langus.d–f Vastuvõtja töökarakteristiku (ROC) kõverad, mis näitavad diskrimineeriva mudeli võimsust, mis põhineb 27 metaboliitide kombinatsioonil avastus-, sise- ja väliskontrollikomplektides.Lähteandmed esitatakse lähteandmete failide kujul.
Nende 27 metaboliidi kaalutud regressioonikoefitsientide põhjal loodi ennustusmudel (täiendav tabel 3).Nendel 27 metaboliidil põhinev ROC analüüs andis kõveraaluse pindala (AUC) väärtuseks 0,933, avastusrühma tundlikkus oli 0,868 ja spetsiifilisus 0,859 (joonis 2d).Samal ajal saavutas LA ja HC vahelise 38 annoteeritud erineva metaboliidi hulgas 16 metaboliidi komplekt AUC 0, 902 tundlikkusega 0, 801 ja spetsiifilisusega 0, 856 LA eristamisel HC-st (täiendav joonis 6a-c).Võrreldi ka AUC väärtusi, mis põhinesid erinevate metaboliitide korduvate muutuste lävedel.Leidsime, et klassifikatsioonimudel toimis LA ja BN (HC) eristamisel kõige paremini, kui voltide muutuse tase oli seatud väärtusele 1, 2 versus 1, 5 või 2, 0 (täiendav joonis 7a, b).27 metaboliitide rühmal põhinevat klassifikatsioonimudelit kinnitati täiendavalt sise- ja välisrühmades.AUC oli 0,915 (tundlikkus 0,867, spetsiifilisus 0,811) sisemise valideerimise korral ja 0,945 (tundlikkus 0,810, spetsiifilisus 0,979) välise valideerimise puhul (joonis 2e, f).Laboritevahelise tõhususe hindamiseks analüüsiti 40 välise kohordi proovi välislaboris, nagu on kirjeldatud jaotises Meetodid.Klassifitseerimise täpsus saavutas AUC 0, 925 (täiendav joonis 8).Kuna kopsu lamerakuline kartsinoom (LUSC) on kopsu adenokartsinoomi (LUAD) järel teine levinuim mitteväikerakk-kopsuvähi (NSCLC) alatüüp, testisime ka metaboolsete profiilide kinnitatud potentsiaalset kasulikkust.BN ja 16 LUSC juhtumit.LUSC ja BN vahelise diskrimineerimise AUC oli 0, 776 (täiendav joonis 9), mis näitab halvemat võimet võrreldes LUAD ja BN vahelise diskrimineerimisega.
Uuringud on näidanud, et sõlmede suurus CT-piltidel on positiivses korrelatsioonis pahaloomulise kasvaja tõenäosusega ja jääb sõlmede ravi peamiseks määrajaks25, 26, 27.NELSONi skriininguuringu suure kohordi andmete analüüs näitas, et pahaloomuliste kasvajate risk isikutel, kelle sõlmed olid alla 5 mm, oli isegi sarnane sõlmedeta isikute riskiga28.Seetõttu on minimaalne suurus, mis nõuab regulaarset CT-seiret, 5 mm, nagu soovitab British Thoracic Society (BTS) ja 6 mm, nagu soovitab Fleischner Society 29 .Kuid sõlmed, mis on suuremad kui 6 mm ja ilma ilmsete healoomuliste tunnusteta, mida nimetatakse määramatuteks kopsusõlmedeks (IPN), jäävad kliinilises praktikas hindamisel ja juhtimisel suureks väljakutseks30, 31.Järgmisena uurisime, kas sõlmede suurus mõjutas metaboolseid signatuure, kasutades avastus- ja sisemiste valideerimisrühmade ühendproove.Keskendudes 27 valideeritud biomarkerile, võrdlesime kõigepealt HC ja BN sub-6 mm metaboloomide PCA profiile.Leidsime, et enamik HC ja BN andmepunkte kattus, mis näitab, et seerumi metaboliitide tase oli mõlemas rühmas sarnane (joonis 3a).Erinevate suurusvahemike tunnuskaardid jäid BN-s ja LA-s säilima (joonis 3b, c), samas kui pahaloomuliste ja healoomuliste sõlmede vahel täheldati eraldumist vahemikus 6–20 mm (joonis 3d).Selle kohordi AUC oli 0,927, spetsiifilisus 0,868 ja tundlikkus 0,820 6 kuni 20 mm suuruste sõlmede pahaloomulisuse ennustamiseks (joonis 3e, f).Meie tulemused näitavad, et klassifikaator suudab fikseerida varajase pahaloomulise transformatsiooni põhjustatud metaboolsed muutused, sõltumata sõlme suurusest.
ad PCA profiilide võrdlus määratud rühmade vahel 27 metaboliidi metaboolse klassifikaatori põhjal.CC ja BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.LA-s 6–20 mm versus LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm ja LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Vastuvõtja töökarakteristiku (ROC) kõver, mis näitab diskrimineeriva mudeli jõudlust 6–20 mm sõlmede puhul.f Tõenäosusväärtused arvutati 6–20 mm suuruste sõlmede logistilise regressiooni mudeli alusel.Hall punktiirjoon tähistab optimaalset piirväärtust (0,455).Ülaltoodud numbrid näitavad Los Angelese prognoositud juhtumite protsenti.Kasutage kahepoolset Studenti t-testi.PCA, põhikomponentide analüüs.AUC pindala kõvera all.Lähteandmed esitatakse lähteandmete failide kujul.
Lisaks valiti neli proovi (vanuses 44–61 aastat), mille kopsusõlmede suurus oli sarnane (7–9 mm), et illustreerida kavandatud pahaloomuliste kasvajate prognoosimise mudeli toimimist (joonis 4a, b).Esialgsel sõeluuringul esitleti juhtumit 1 tahke sõlmena koos lupjumisega, mis on seotud healoomulisusega, samas kui juhtum 2 oli ebamäärane osaliselt tahke sõlme, millel polnud ilmseid healoomulisi tunnuseid.Kolm järelkontrolli CT-skaneerimist näitasid, et need juhtumid püsisid stabiilsena 4-aastase perioodi jooksul ja seetõttu peeti neid healoomulisteks sõlmedeks (joonis 4a).Võrreldes seeria CT-skaneeringute kliinilise hindamisega tuvastas ühekordse seerumi metaboliitide analüüs praeguse klassifikaatori mudeliga need healoomulised sõlmed kiiresti ja õigesti, tuginedes tõenäosuslikele piirangutele (tabel 1).Joonisel 4b juhtumil 3 on kujutatud pleura tagasitõmbumise tunnustega sõlme, mis on kõige sagedamini seotud pahaloomulise kasvajaga32.Juhtum 4 esitati ebamäärase osaliselt tahke sõlmena, millel puuduvad tõendid healoomulise põhjuse kohta.Kõik need juhtumid ennustati klassifikaatori mudeli järgi pahaloomulisteks (tabel 1).Kopsu adenokartsinoomi hindamist demonstreeris histopatoloogiline uuring pärast kopsu resektsiooni operatsiooni (joonis 4b).Välise valideerimiskomplekti jaoks ennustas metaboolne klassifikaator täpselt kahte määramatute kopsusõlmede juhtumit, mis olid suuremad kui 6 mm (täiendav joonis 10).
Kahe healoomuliste sõlmede juhtumi kopsude aksiaalse akna CT-pildid.Juhtumi 1 puhul näitas CT-skaneerimine 4 aasta pärast stabiilset tahket sõlme mõõtmetega 7 mm koos lupjumisega paremas alumises labas.2. juhul tuvastas CT-skaneerimine 5 aasta pärast paremas ülemises sagaras stabiilse, osaliselt tahke 7 mm läbimõõduga sõlme.b Kopsude aksiaalsed CT-pildid ja vastavad patoloogilised uuringud kahe I staadiumi adenokartsinoomi juhtumi kohta enne kopsude resektsiooni.Juhtum 3 paljastas 8 mm läbimõõduga sõlme paremas ülasagaras koos pleura tagasitõmbega.Juhtum 4 paljastas vasakpoolses ülemises labas osaliselt tahke lihvklaasist sõlme mõõtmetega 9 mm.Resekteeritud kopsukoe hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimine (skaala riba = 50 μm), mis näitab kopsu adenokartsinoomi atsinaarset kasvumustrit.Nooled näitavad CT-piltidel tuvastatud sõlmesid.H&E kujutised on tüüpilised kujutised mitmest (> 3) mikroskoopilisest väljast, mida patoloog on uurinud.
Kokkuvõttes näitavad meie tulemused seerumi metaboliitide biomarkerite potentsiaalset väärtust kopsusõlmede diferentsiaaldiagnostikas, mis võib tekitada probleeme CT-sõeluuringu hindamisel.
Valideeritud diferentsiaalse metaboliitide paneeli põhjal püüdsime tuvastada peamiste metaboolsete muutuste bioloogilisi korrelatsioone.MetaboAnalysti KEGG raja rikastamise analüüs tuvastas 6 ühist oluliselt muutunud rada kahe antud rühma vahel (LA vs. HC ja LA vs. BN, kohandatud p ≤ 0,001, efekt > 0,01).Neid muutusi iseloomustasid häired püruvaadi metabolismis, trüptofaani metabolismis, niatsiini ja nikotiinamiidi metabolismis, glükolüüsis, TCA tsüklis ja puriini metabolismis (joonis 5a).Seejärel teostasime täiendavalt sihipärast metaboolikat, et kontrollida olulisi muutusi absoluutse kvantifitseerimise abil.Tavaliste metaboliitide määramine tavaliselt muudetud radadel kolmekordse kvadrupoolse massispektromeetria (QQQ) abil, kasutades autentseid metaboliitide standardeid.Metaboloomika uuringu sihtproovi demograafilised omadused on lisatud täiendavasse tabelisse 4. Kooskõlas meie globaalsete metaboloomika tulemustega kinnitas kvantitatiivne analüüs, et hüpoksantiini ja ksantiini, püruvaadi ja laktaadi sisaldus LA-s suurenes võrreldes BN ja HC-ga (joonised 5b, c, p <0,05).Siiski ei leitud BN ja HC vahel olulisi erinevusi nende metaboliitide vahel.
LA rühma oluliselt erinevate metaboliitide KEGG raja rikastamise analüüs võrreldes BN ja HC rühmadega.Kasutati kahepoolset Globaltesti ja p väärtused kohandati Holm-Bonferroni meetodil (kohandatud p ≤ 0,001 ja efekti suurus> 0,01).b–d Viiuli graafikud, mis näitavad hüpoksantiini, ksantiini, laktaadi, püruvaadi ja trüptofaani taset seerumi HC-, BN- ja LA-s, mis on määratud LC-MS/MS-ga (n = 70 rühma kohta).Valged ja mustad punktiirjooned näitavad vastavalt mediaani ja kvartiili.e Viiuli graafik, mis näitab SLC7A5 ja QPRT normaliseeritud Log2TPM (transkripte miljoni kohta) mRNA ekspressiooni kopsu adenokartsinoomi korral (n = 513) võrreldes normaalse kopsukoega (n = 59) LUAD-TCGA andmekogumis.Valge kast tähistab interkvartiilide vahemikku, horisontaalne must joon keskel tähistab mediaani ja kastist ulatuv vertikaalne must joon tähistab 95% usaldusvahemikku (CI).f Pearsoni korrelatsioonigraafik SLC7A5 ja GAPDH ekspressioonist kopsu adenokartsinoomi (n = 513) ja normaalse kopsukoe (n = 59) korral TCGA andmekogumis.Hall ala tähistab 95% CI-d.r, Pearsoni korrelatsioonikordaja.g Normaliseeritud raku trüptofaani tase A549 rakkudes, mis on transfekteeritud mittespetsiifilise shRNA kontrolliga (NC) ja shSLC7A5 (Sh1, Sh2), määrati LC-MS/MS abil.Esitatakse viie bioloogiliselt sõltumatu proovi statistiline analüüs igas rühmas.h NADt rakutasemed (kogu NAD, sealhulgas NAD+ ja NADH) A549 rakkudes (NC) ja SLC7A5 knockdown A549 rakkudes (Sh1, Sh2).Esitatakse iga rühma kolme bioloogiliselt sõltumatu proovi statistiline analüüs.i A549 rakkude glükolüütilist aktiivsust enne ja pärast SLC7A5 katkestamist mõõdeti ekstratsellulaarse hapestumise kiirusega (ECAR) (n = 4 bioloogiliselt sõltumatut proovi rühma kohta).2-DG,2-desoksü-D-glükoos.Kahesabalist Studenti t-testi kasutati punktis (b–h).Punktis (g – i) tähistavad vearibad keskmist ± SD, iga katse viidi läbi kolm korda sõltumatult ja tulemused olid sarnased.Lähteandmed esitatakse lähteandmete failide kujul.
Arvestades muutunud trüptofaani metabolismi olulist mõju LA rühmas, hindasime QQQ abil ka seerumi trüptofaani taset HC, BN ja LA rühmades.Leidsime, et seerumi trüptofaani tase vähenes LA-s võrreldes HC või BN-ga (p < 0,001, joonis 5d), mis on kooskõlas varasemate leidudega, et tsirkuleeriva trüptofaani tase on kopsuvähiga patsientidel madalam kui kontrollrühma tervetel kontrollidel33, 34 ,35.Teises uuringus, milles kasutati PET/CT märgistusainet 11C-metüül-L-trüptofaani, leiti, et trüptofaani signaali retentsiooniaeg kopsuvähi koes oli märkimisväärselt pikenenud võrreldes healoomuliste kahjustuste või normaalse koega36.Me oletame, et trüptofaani vähenemine LA seerumis võib peegeldada aktiivset trüptofaani omastamist kopsuvähirakkude poolt.
Samuti on teada, et trüptofaani katabolismi kinureniini raja lõpp-produkt on NAD+37,38, mis on oluline substraat glütseraldehüüd-3-fosfaadi ja 1,3-bisfosfoglütseraadi reaktsiooniks glükolüüsis39.Kuigi varasemad uuringud on keskendunud trüptofaani katabolismi rollile immuunregulatsioonis, püüdsime selgitada trüptofaani düsregulatsiooni ja käesolevas uuringus täheldatud glükolüütiliste radade koostoimet.Lahustunud transporteri perekonna 7 liige 5 (SLC7A5) on teadaolevalt trüptofaani transporter43,44,45.Kinoliinhappe fosforibosüültransferaas (QPRT) on ensüüm, mis asub kinureniini rajast allavoolu ja muudab kinoliinhappe NAMN46-ks.LUAD TCGA andmestiku kontrollimisel selgus, et nii SLC7A5 kui ka QPRT olid normaalse koega võrreldes oluliselt ülesreguleeritud kasvajakoes (joonis 5e).Seda suurenemist täheldati kopsu adenokartsinoomi I ja II staadiumis ning III ja IV staadiumis (täiendav joonis 11), mis näitab kasvaja tekkega seotud trüptofaani metabolismi varaseid häireid.
Lisaks näitas LUAD-TCGA andmestik positiivset korrelatsiooni SLC7A5 ja GAPDH mRNA ekspressiooni vahel vähihaigete proovides (r = 0,45, p = 1,55E-26, joonis 5f).Seevastu normaalses kopsukoes selliste geenisignatuuride vahel olulist korrelatsiooni ei leitud (r = 0, 25, p = 0, 06, joonis 5f).SLC7A5 (täiendav joonis 12) hävitamine A549 rakkudes vähendas oluliselt raku trüptofaani ja NAD(H) taset (joonis 5g, h), mille tulemuseks oli glükolüütilise aktiivsuse nõrgenemine, mõõdetuna rakuvälise hapestumise kiirusega (ECAR) (joonis 1).5i).Seega oletame seerumi metaboolsete muutuste ja in vitro tuvastamise põhjal, et trüptofaani metabolism võib kinureniini raja kaudu toota NAD + ja mängida olulist rolli glükolüüsi soodustamisel kopsuvähi korral.
Uuringud on näidanud, et suur hulk LDCT-ga tuvastatud määramatuid kopsusõlmesid võib pahaloomulise kasvaja valepositiivse diagnoosi tõttu põhjustada täiendavaid uuringuid, nagu PET-CT, kopsubiopsia ja üleravi.31 Nagu on näidatud joonisel 6, meie uuring tuvastas potentsiaalse diagnostilise väärtusega seerumi metaboliitide paneeli, mis võib parandada riski kihistumist ja järgnevat CT-ga tuvastatud kopsusõlmede juhtimist.
Kopsusõlmede hindamiseks kasutatakse väikese doosiga kompuutertomograafiat (LDCT), millel on hea- või pahaloomulistele põhjustele viitavad pildiomadused.Sõlmede ebakindel tulemus võib põhjustada sagedasi kontrollvisiite, tarbetuid sekkumisi ja üleravi.Diagnostilise väärtusega seerumi metaboolsete klassifikaatorite lisamine võib parandada riski hindamist ja sellele järgnevat kopsusõlmede ravi.PET positronemissioontomograafia.
USA NLST uuringu ja Euroopa NELSONi uuringu andmed viitavad sellele, et kõrge riskiga rühmade sõelumine väikese doosiga kompuutertomograafiaga (LDCT) võib vähendada kopsuvähki suremust1,3.Siiski on LDCT abil tuvastatud suure hulga juhuslike kopsusõlmede riskihindamine ja sellele järgnev kliiniline juhtimine endiselt kõige keerulisem.Peamine eesmärk on optimeerida olemasolevate LDCT-põhiste protokollide õiget klassifikatsiooni, lisades usaldusväärsed biomarkerid.
Teatud molekulaarsed biomarkerid, nagu vere metaboliidid, on tuvastatud, võrreldes kopsuvähki tervete kontrollidega15, 17.Käesolevas uuringus keskendusime seerumi metaboolse analüüsi rakendamisele, et eristada LDCT poolt juhuslikult tuvastatud healoomulisi ja pahaloomulisi kopsusõlmesid.Võrdlesime terve kontrolli (HC), healoomuliste kopsusõlmede (BN) ja I staadiumi kopsu adenokartsinoomi (LA) proovide globaalset seerumi metaboloomi, kasutades UPLC-HRMS analüüsi.Leidsime, et HC ja BN olid sarnase metaboolse profiiliga, samas kui LA näitas olulisi muutusi võrreldes HC ja BN-ga.Tuvastasime kaks seerumi metaboliitide komplekti, mis eristavad LA-d HC-st ja BN-st.
Praegune healoomuliste ja pahaloomuliste sõlmede LDCT-põhine identifitseerimisskeem põhineb peamiselt sõlmede suurusel, tihedusel, morfoloogial ja kasvukiirusel aja jooksul30.Varasemad uuringud on näidanud, et sõlmede suurus on tihedalt seotud kopsuvähi tõenäosusega.Isegi kõrge riskiga patsientidel on pahaloomuliste kasvajate risk <6 mm sõlmedes <1%.Pahaloomuliste kasvajate risk 6–20 mm suuruste sõlmede korral on vahemikus 8–64%30.Seetõttu soovitab Fleischneri Ühing tavapäraseks CT jälgimiseks 6 mm läbimõõtu.29 Siiski ei ole üle 6 mm suuruste määramatute kopsusõlmede (IPN) riskianalüüsi ja juhtimist piisavalt läbi viidud31.Kaasasündinud südamehaiguse praegune ravi põhineb tavaliselt valvel ootamisel koos sagedase CT-seirega.
Valideeritud metaboloomi põhjal demonstreerisime esimest korda metaboolsete signatuuride kattumist tervete isikute ja healoomuliste sõlmede vahel, mille suurus on <6 mm.Bioloogiline sarnasus on kooskõlas varasemate CT leidudega, mille kohaselt on alla 6 mm sõlmede korral pahaloomuliste kasvajate risk sama madal kui sõlmedeta isikutel.30 Tuleb märkida, et meie tulemused näitavad ka, et healoomuliste sõlmede puhul <6 mm ja ≥6 mm metaboolsete profiilide sarnasus, mis viitab sellele, et healoomulise etioloogia funktsionaalne määratlus on ühtlane sõltumata sõlme suurusest.Seega võivad kaasaegsed diagnostilised seerumi metaboliitide paneelid pakkuda välistustestina ühe analüüsi, kui CT-s avastatakse algselt sõlmed, ja see võib potentsiaalselt vähendada seeriaseiret.Samal ajal eristas sama metaboolsete biomarkerite paneel ≥6 mm suuruseid pahaloomulisi sõlmesid healoomulistest sõlmedest ja andis täpsed prognoosid sarnase suurusega IPN-ide ja mitmetähenduslike morfoloogiliste tunnuste kohta CT-piltidel.See seerumi metabolismi klassifikaator toimis hästi sõlmede pahaloomulisuse ennustamisel ≥6 mm AUC-ga 0,927.Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et unikaalsed seerumi metaboolsed allkirjad võivad spetsiifiliselt peegeldada varajasi kasvaja põhjustatud metaboolseid muutusi ja neil võib olla potentsiaalne väärtus riski ennustajatena, sõltumata sõlme suurusest.
Eelkõige on kopsu adenokartsinoom (LUAD) ja lamerakk-kartsinoom (LUSC) mitteväikerakk-kopsuvähi (NSCLC) peamised tüübid.Arvestades, et LUSC on tugevalt seotud tubakatarbimisega47 ja LUAD on CT-sõeluuringul tuvastatud juhuslike kopsusõlmede kõige levinum histoloogia48, loodi meie klassifikaatori mudel spetsiaalselt I staadiumi adenokartsinoomi proovide jaoks.Wang ja tema kolleegid keskendusid ka LUAD-ile ja tuvastasid üheksa lipiidisignatuuri, kasutades lipidoomikat, et eristada varajases staadiumis kopsuvähki tervetest inimestest17.Testisime praegust klassifikaatori mudelit 16 I etapi LUSC ja 74 healoomulise sõlme juhtumiga ning täheldasime madalat LUSC ennustustäpsust (AUC 0, 776), mis viitab sellele, et LUAD-il ja LUSC-l võivad olla oma metaboolsed allkirjad.Tõepoolest, on näidatud, et LUAD ja LUSC erinevad etioloogia, bioloogilise päritolu ja geneetiliste kõrvalekallete poolest49.Seetõttu tuleks sõeluuringuprogrammides kopsuvähi populatsioonipõhise tuvastamise koolitusmudelitesse kaasata muud tüüpi histoloogiat.
Siin tuvastasime kuus kõige sagedamini muutunud kopsu adenokartsinoomi rada võrreldes tervete kontrollide ja healoomuliste sõlmedega.Ksantiin ja hüpoksantiin on puriini ainevahetusraja tavalised metaboliidid.Kooskõlas meie tulemustega suurenesid puriini metabolismiga seotud vaheühendid kopsu adenokartsinoomiga patsientide seerumis või kudedes võrreldes tervete kontrollidega või preinvasiivse staadiumis patsientidega 15, 50.Kõrgenenud seerumi ksantiini ja hüpoksantiini tase võib peegeldada anabolismi, mida nõuavad kiiresti vohavad vähirakud.Glükoosi metabolismi düsregulatsioon on vähi metabolismi hästi tuntud tunnus51.Siin täheldasime LA rühmas püruvaadi ja laktaadi olulist suurenemist võrreldes HC ja BN rühmaga, mis on kooskõlas varasemate aruannetega glükolüütiliste radade kõrvalekallete kohta mitteväikerakk-kopsuvähi (NSCLC) patsientide seerumi metaboolsetes profiilides ja terved kontrollid.tulemused on ühtsed52,53.
Oluline on see, et kopsu adenokartsinoomide seerumis täheldasime pöördvõrdelist korrelatsiooni püruvaadi ja trüptofaani metabolismi vahel.Seerumi trüptofaani tase langes LA rühmas võrreldes HC või BN rühmaga.Huvitaval kombel leiti eelmises suuremahulises uuringus, milles kasutati potentsiaalset kohorti, et tsirkuleeriva trüptofaani madal tase on seotud suurenenud kopsuvähi riskiga 54 .Trüptofaan on asendamatu aminohape, mida saame täielikult toidust.Me järeldame, et seerumi trüptofaani vähenemine kopsu adenokartsinoomi korral võib kajastada selle metaboliidi kiiret ammendumist.On hästi teada, et trüptofaani katabolismi lõpp-produkt kinureniini raja kaudu on de novo NAD+ sünteesi allikas.Kuna NAD+ toodetakse peamiselt päästetee kaudu, tuleb NAD+ tähtsus trüptofaani metabolismis tervises ja haigustes veel kindlaks teha46.Meie TCGA andmebaasi analüüs näitas, et trüptofaani transporteri lahustunud aine transporteri 7A5 (SLC7A5) ekspressioon suurenes kopsu adenokartsinoomi korral normaalsete kontrollidega võrreldes oluliselt ja oli positiivses korrelatsioonis glükolüütilise ensüümi GAPDH ekspressiooniga.Varasemad uuringud on keskendunud peamiselt trüptofaani katabolismi rollile kasvajavastase immuunvastuse pärssimisel 40, 41, 42.Siin demonstreerime, et trüptofaani omastamise pärssimine SLC7A5 katkestamisega kopsuvähirakkudes põhjustab järgnevat raku NAD taseme langust ja samaaegset glükolüütilise aktiivsuse nõrgenemist.Kokkuvõttes annab meie uuring bioloogilise aluse seerumi metabolismi muutustele, mis on seotud kopsu adenokartsinoomi pahaloomulise transformatsiooniga.
EGFR-i mutatsioonid on NSCLC-ga patsientide kõige levinumad juhtmutatsioonid.Meie uuringus leidsime, et EGFR-i mutatsiooniga patsientidel (n = 41) olid üldised metaboolsed profiilid sarnased metsiktüüpi EGFR-iga patsientidega (n = 31), kuigi leidsime atsüülkarnitiini patsientidel mõnede EGFR-i mutantidega patsientide seerumitaseme langust.Atsüülkarnitiinide väljakujunenud ülesanne on transportida atsüülrühmad tsütoplasmast mitokondriaalsesse maatriksisse, mis viib rasvhapete oksüdeerumiseni energia tootmiseks 55 .Kooskõlas meie leidudega tuvastati hiljutises uuringus ka sarnased metaboolsed profiilid EGFR-i mutantide ja EGFR-i metsiktüüpi kasvajate vahel, analüüsides 102 kopsu adenokartsinoomi koeproovi globaalset metaboloomi50.Huvitaval kombel leiti atsüülkarnitiini sisaldus ka EGFR-i mutantide rühmas.Seega, kas atsüülkarnitiini taseme muutused peegeldavad EGFR-i indutseeritud metaboolseid muutusi ja aluseks olevaid molekulaarseid radu, võivad vajada täiendavat uurimist.
Kokkuvõtteks võib öelda, et meie uuring loob seerumi metaboolse klassifikaatori kopsusõlmede diferentsiaaldiagnostikaks ja pakub välja töövoo, mis võib optimeerida riskianalüüsi ja hõlbustada kliinilist juhtimist CT-skaneerimise sõeluuringul.
Selle uuringu kiitsid heaks Sun Yat-seni ülikooli vähihaigla eetikakomitee, Sun Yat-seni ülikooli esimene sidushaigla ja Zhengzhou ülikooli vähihaigla eetikakomitee.Avastamise ja sisemise valideerimise rühmades koguti 174 seerumit tervetelt isikutelt ja 244 seerumit healoomulistest sõlmedest isikutelt, kes läbisid iga-aastaseid arstlikke läbivaatusi Sun Yat-seni ülikooli vähikeskuse vähikontrolli ja ennetamise osakonnas, ja 166 healoomulist sõlme.seerum.I etapi kopsu adenokartsinoomid koguti Sun Yat-seni ülikooli vähikeskusest.Väliskontrolli kohordis oli 48 healoomuliste sõlmede juhtu, 39 I staadiumi kopsu adenokartsinoomi juhtu Sun Yat-seni ülikooli esimesest sidushaiglast ja 24 I staadiumi kopsu adenokartsinoomi juhtumit Zhengzhou vähihaiglast.Sun Yat-seni ülikooli vähikeskus kogus ka 16 I staadiumi lamerakk-kopsuvähi juhtumit, et testida väljakujunenud metaboolse klassifikaatori diagnostilist võimet (patsiendi omadused on näidatud täiendavas tabelis 5).Proovid avastuskohordist ja sisemisest valideerimiskohordist koguti ajavahemikus jaanuar 2018 kuni mai 2020. Välise valideerimiskohordi proovid koguti ajavahemikus august 2021 kuni oktoober 2022. Soolise eelarvamuse minimeerimiseks määrati mõlemale ligikaudu võrdne arv meeste ja naiste juhtumeid. kohort.Avastusmeeskond ja sisekontrollimeeskond.Osaleja sugu määrati enesearuande põhjal.Kõigilt osalejatelt saadi teadlik nõusolek ja hüvitist ei antud.Healoomuliste sõlmedega subjektid olid need, kellel oli analüüsi ajal stabiilne CT-skannimise skoor 2–5 aasta jooksul, välja arvatud 1 juhtum välise valideerimise proovist, mis koguti enne operatsiooni ja diagnoositi histopatoloogiliselt.Välja arvatud krooniline bronhiit.Kopsu adenokartsinoomi juhtumid koguti enne kopsu resektsiooni ja kinnitati patoloogilise diagnoosiga.Tühja kõhuga vereproovid koguti seerumi eraldamise katsutitesse ilma antikoagulantideta.Vereproove hüübiti 1 tund toatemperatuuril ja seejärel tsentrifuugiti 2851 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C, et koguda seerumi supernatant.Seerumi alikvoodid külmutati -80 °C juures kuni metaboliidi ekstraheerimiseni.Sun Yat-seni ülikooli vähikeskuse vähiennetuse ja meditsiinilise läbivaatuse osakond kogus seerumikogumi 100 tervelt doonorilt, sealhulgas võrdselt 40–55-aastastelt meestelt ja naistelt.Iga doonoriproovi segati võrdsetes kogustes, saadud kogum jaotati alikvootideks ja säilitati temperatuuril -80 °C.Seerumi segu kasutati võrdlusmaterjalina kvaliteedikontrolliks ja andmete standardiseerimiseks.
Võrdlusseerum ja testproovid sulatati ja metaboliidid ekstraheeriti kombineeritud ekstraheerimismeetodil (MTBE/metanool/vesi)56.Lühidalt, 50 μl seerumit segati 225 μl jääkülma metanooli ja 750 μl jääkülma metüül-tert-butüüleetriga (MTBE).Segage segu ja inkubeerige jääl 1 tund.Seejärel segati proovid ja segati keerisega 188 μl MS-klassi veega, mis sisaldas sisestandardeid (13C-laktaat, 13C3-püruvaat, 13C-metioniin ja 13C6-isoleutsiin, ostetud ettevõttest Cambridge Isotope Laboratories).Seejärel tsentrifuugiti segu 15 000 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C ja alumine faas viidi kahte katsutisse (mõlemad 125 μL) LC-MS analüüsiks positiivses ja negatiivses režiimis.Lõpuks aurustati proov kiires vaakumkontsentraatoris kuivaks.
Kuivatatud metaboliidid taastati 120 μl 80% atsetonitriilis, segati vorteksiga 5 minutit ja tsentrifuugiti 15 000 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C.Supernatandid viidi metaboolsete uuringute jaoks merevaigukollastesse klaasviaalidesse, millel olid mikrosisendid.Sihtotstarbeta metaboolika analüüs üliefektiivse vedelikkromatograafia-kõrge eraldusvõimega massispektromeetria (UPLC-HRMS) platvormil.Metaboliidid eraldati Dionex Ultimate 3000 UPLC süsteemi ja ACQUITY BEH amiidkolonni (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) abil.Positiivse iooni režiimis olid liikuvateks faasideks 95% (A) ja 50% atsetonitriili (B), millest igaüks sisaldas 10 mmol/l ammooniumatsetaati ja 0,1% sipelghapet.Negatiivses režiimis sisaldasid liikuvad faasid A ja B vastavalt 95% ja 50% atsetonitriili, mõlemad faasid sisaldasid 10 mmol/L ammooniumatsetaati, pH = 9. Gradiendi programm oli järgmine: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98–2% B;16,1–20 min, 2% B. Kolonni hoiti 40 °C ja proovi 10 °C juures automaatses proovivõtturis.Voolukiirus oli 0,3 ml/min, süstimismaht 3 μl.Elektropihustusionisatsiooni (ESI) allikaga Q-Exactive Orbittrap massispektromeetrit (Thermo Fisher Scientific) kasutati täisskaneerimise režiimis ja ühendati ddMS2 jälgimisrežiimiga, et koguda suuri andmemahtusid.MS parameetrid määrati järgmiselt: pihustuspinge +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillaari temperatuur 320°C, kaitsegaas 40 arb, abigaas 10 arb, sondi küttekeha temperatuur 350°C, skaneerimisvahemik 70-1050 m/h, resolutsioon.70 000. Andmed saadi Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) abil.
Andmete kvaliteedi hindamiseks loodi ühendatud kvaliteedikontrolli (QC) proovid, eemaldades igast proovist 10 μl supernatandi alikvoodid.UPLC-MS süsteemi stabiilsuse hindamiseks analüüsiti analüütilise järjestuse alguses kuut kvaliteedikontrolli proovisüsti.Seejärel viiakse partiisse perioodiliselt kvaliteedikontrolli proove.Kõiki selle uuringu 11 seerumiproovi partiid analüüsiti LC-MS abil.Ekstraheerimisprotsessi jälgimiseks ja partiidevahelise toime kohandamiseks kasutati vastavates partiides võrdlusmaterjalina 100 tervelt doonorilt saadud seerumi kogumi segu alikvoote.Avastuskohordi, sisemise valideerimise kohordi ja välise valideerimise kohordi metaboolika sihipärane analüüs viidi läbi Sun Yat-seni ülikooli metaboolikakeskuses.Guangdongi Tehnikaülikooli analüüsi- ja testimiskeskuse väline labor analüüsis klassifikaatori mudeli toimivuse testimiseks ka välise kohordi 40 proovi.
Pärast ekstraheerimist ja taastamist mõõdeti seerumi metaboliitide absoluutset kvantifitseerimist, kasutades ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetriat (Agilent 6495 kolmekordne kvadrupool) elektropihustusionisatsiooni (ESI) allikaga mitme reaktsiooni jälgimise (MRM) režiimis.Metaboliitide eraldamiseks kasutati ACQUITY BEH amiidkolonni (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Liikuv faas koosnes 90% (A) ja 5% atsetonitriilist (B) koos 10 mmol/l ammooniumatsetaadi ja 0,1% ammoniaagilahusega.Gradientprogramm oli järgmine: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0%B.Kolonni hoiti automaatses proovivõtturis temperatuuril 40 °C ja proovi 10 °C juures.Voolukiirus oli 0,3 ml/min ja süstimismaht 1 µl.MS parameetrid määrati järgmiselt: kapillaarpinge ±3,5 kV, nebulisaatori rõhk 35 psi, mantligaasi vool 12 L/min, mantligaasi temperatuur 350 °C, kuivatusgaasi temperatuur 250 °C ja kuivatusgaasi vool 14 l/min.Trüptofaani, püruvaadi, laktaadi, hüpoksantiini ja ksantiini MRM-i konversioonid olid 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 ja 151,0–107.9 vastavalt.Andmed koguti Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) abil.Seerumiproovide puhul määrati trüptofaan, püruvaat, laktaat, hüpoksantiini ja ksantiini sisaldus standardsegulahuste kalibreerimiskõverate abil.Rakuproovide puhul normaliseeriti trüptofaani sisaldus sisestandardi ja rakuvalgu massi järgi.
Piigi ekstraheerimine (m/z ja retentsiooniaeg (RT)) viidi läbi, kasutades Compound Discovery 3.1 ja TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Partiidevaheliste potentsiaalsete erinevuste kõrvaldamiseks jagati suhtelise arvukuse saamiseks katseproovi iga iseloomulik piik sama partii võrdlusmaterjali iseloomuliku piigiga.Sisestandardite suhtelised standardhälbed enne ja pärast standardimist on näidatud täiendavas tabelis 6. Kahe rühma vahelisi erinevusi iseloomustas valede avastamise määr (FDR<0,05, Wilcoxoni märgistatud auaste test) ja kordne muutus (>1,2 või <0,83).Ekstraheeritud funktsioonide töötlemata MS-andmed ja seerumiga korrigeeritud MS-i võrdlusandmed on näidatud vastavalt lisaandmetes 1 ja lisaandmetes 2.Maksimaalne annotatsioon viidi läbi nelja määratletud identifitseerimistaseme põhjal, sealhulgas tuvastatud metaboliidid, oletatavalt annoteeritud ühendid, oletatavalt iseloomustatud ühendiklassid ja tundmatud ühendid22.Tuginedes andmebaasi otsingutele rakenduses Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), valiti diferentsiaalmetaboloomi vaheühenditeks lõpuks bioloogilised ühendid, mille MS/MS kattuvad valideeritud standardid või täpse vaste annotatsioonid mzCloudis (skoor > 85) või Chemspider.Iga funktsiooni tippmärkused on lisatud 3. lisaandmetesse. MetaboAnalyst 5.0 kasutati summaariseeritud metaboliitide arvukuse ühemõõtmeliseks analüüsiks.MetaboAnalyst 5.0 hindas ka KEGG raja rikastamise analüüsi, mis põhines oluliselt erinevatel metaboliitidel.Põhikomponentide analüüsi (PCA) ja osalise vähimruutude diskrimineerimisanalüüsi (PLS-DA) analüüsiti tarkvarapaketi ropls (v.1.26.4) abil koos virna normaliseerimise ja automaatse skaleerimisega.Optimaalne metaboliitide biomarkeri mudel sõlme pahaloomulisuse ennustamiseks loodi binaarse logistilise regressiooni abil koos vähima absoluutse kahanemise ja selektsioonioperaatoriga (LASSO, R pakett v.4.1-3).Diskrimineeriva mudeli jõudlust tuvastamis- ja valideerimiskomplektides iseloomustati AUC hindamisega ROC analüüsi põhjal vastavalt pROC paketile (v.1.18.0.).Optimaalne tõenäosuse piirväärtus saadi mudeli maksimaalse Youdeni indeksi (tundlikkus + spetsiifilisus – 1) põhjal.Proovid, mille väärtused on läviväärtusest väiksemad või suuremad, ennustatakse vastavalt healoomuliste sõlmede ja kopsu adenokartsinoomina.
A549 rakke (#CCL-185, American Type Culture Collection) kasvatati F-12K söötmes, mis sisaldas 10% FBS-i.Lentiviiruse vektorisse pLKO.1-puro sisestati SLC7A5 sihtmärgiks olevad lühikesed juuksenõela RNA (shRNA) järjestused ja mittesihtiv kontroll (NC).ShSLC7A5 antisenss-järjestused on järgmised: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').SLC7A5 (#5347) ja tubuliini (#2148) vastased antikehad osteti ettevõttest Cell Signaling Technology.SLC7A5 ja tubuliini vastaseid antikehi kasutati Western blot analüüsi jaoks lahjenduses 1:1000.
Seahorse XF glükolüütiline stressitest mõõdab ekstratsellulaarse hapestumise (ECAR) taset.Analüüsis manustati järjestikku glükoosi, oligomütsiini A ja 2-DG-d, et testida raku glükolüütilist võimet, mõõdetuna ECAR-ga.
Mittesihtiva kontrolliga (NC) ja shSLC7A5 (Sh1, Sh2) transfekteeritud A549 rakud plaaditi üleöö 10 cm läbimõõduga tassidele.Rakkude metaboliidid ekstraheeriti 1 ml jääkülma 80% metanooli vesilahusega.Metanoolilahuses olevad rakud kaabiti ära, koguti uude katsutisse ja tsentrifuugiti 15 000 × g juures 15 minutit temperatuuril 4 °C.Koguge 800 µl supernatanti ja kuivatage, kasutades kiiret vaakumkontsentraatorit.Seejärel analüüsiti kuivatatud metaboliidigraanuleid trüptofaani taseme suhtes, kasutades LC-MS/MS-i, nagu ülalpool kirjeldatud.Raku NAD(H) taset A549 rakkudes (NC ja shSLC7A5) mõõdeti, kasutades kvantitatiivset NAD+/NADH kolorimeetrilist komplekti (#K337, BioVision) vastavalt tootja juhistele.Metaboliitide koguse normaliseerimiseks mõõdeti iga proovi valgu taset.
Valimi suuruse esialgseks määramiseks ei kasutatud statistilisi meetodeid.Varasemaid biomarkerite avastamisele suunatud metaboolika uuringuid 15, 18 on peetud suuruse määramise võrdlusalusteks ja võrreldes nende aruannetega oli meie valim piisav.Uuringu kohordist ei jäetud välja ühtegi proovi.Seerumiproovid jaotati juhuslikult avastusrühma (306 juhtu, 74,6%) ja sisemisse valideerimisrühma (104 juhtu, 25,4%) sihtmärgita metaboolsete uuringute jaoks.Samuti valisime igast rühmast juhuslikult 70 juhtumit sihipäraste metaboolsete uuringute avastuskomplektist.Uurijad olid LC-MS andmete kogumise ja analüüsi ajal rühmade määramise suhtes pimedad.Metaboolsete andmete statistilisi analüüse ja rakukatseid kirjeldatakse vastavates tulemuste, jooniste legendide ja meetodite jaotistes.Rakulise trüptofaani, NADT ja glükolüütilise aktiivsuse kvantifitseerimine viidi läbi kolm korda sõltumatult identsete tulemustega.
Uuringu ülesehituse kohta lisateabe saamiseks vaadake selle artikliga seotud loomuliku portfelli aruande kokkuvõtet.
Ekstraheeritud funktsioonide töötlemata MS-andmed ja võrdlusseerumi normaliseeritud MS-andmed on näidatud vastavalt lisaandmetes 1 ja lisaandmetes 2.Diferentsiaalomaduste tippmärkused on esitatud 3. lisaandmetes. LUAD TCGA andmekogumi saab alla laadida aadressilt https://portal.gdc.cancer.gov/.Sisendandmed graafiku koostamiseks on toodud lähteandmetes.Selle artikli jaoks on esitatud lähteandmed.
National Lung Screening Study Group jne. Kopsuvähi suremuse vähendamine väikese doosiga kompuutertomograafiaga.Põhja-Inglismaa.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ja Prophet, PC Kopsuvähi sõeluuring väikese annuse spiraalse CT abil: riikliku kopsusõeluuringu (NLST) tulemused.J. Med.Ekraan 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ et al.Kopsuvähi suremuse vähendamine mahulise CT-sõeluuringuga randomiseeritud uuringus.Põhja-Inglismaa.J. Med.382, 503–513 (2020).
Postitusaeg: 18. september 2023