Kompuutertomograafia (KT) abil tuvastatud kopsu sõlmede diferentsiaaldiagnostika on kliinilises praktikas jätkuvalt väljakutse. Käesolevas uuringus iseloomustame 480 seerumiproovi globaalset metaboloomi, sealhulgas tervete kontrollisikute, healoomuliste kopsu sõlmede ja I staadiumi kopsu adenokartsinoomi metaboloomset profiili. Adenokartsinoomidel on ainulaadsed metaboloomilised profiilid, samas kui healoomulistel sõlmedel ja tervetel inimestel on metaboloomiliste profiilide osas suur sarnasus. Avastusrühmas (n = 306) tuvastati 27 metaboliidi komplekt, mis võimaldab eristada healoomulisi ja pahaloomulisi sõlmi. Diskrimineeriva mudeli AUC oli sisemise valideerimise (n = 104) ja välise valideerimise (n = 111) rühmas vastavalt 0,915 ja 0,945. Raja analüüs näitas kopsu adenokartsinoomi seerumis suurenenud glükolüütiliste metaboliitide hulka, mis oli seotud trüptofaani vähenemisega võrreldes healoomuliste sõlmede ja tervete kontrollisikutega, ning viitas sellele, et trüptofaani omastamine soodustab glükolüüsi kopsuvähirakkudes. Meie uuring rõhutab seerumi metaboliitide biomarkerite väärtust KT abil tuvastatud kopsu sõlmede riski hindamisel.
Varajane diagnoosimine on vähihaigete elulemuse parandamiseks kriitilise tähtsusega. USA riikliku kopsuvähi sõeluuringu (NLST) ja Euroopa NELSONi uuringu tulemused on näidanud, et madala doosiga kompuutertomograafia (LDCT) abil sõeluuring võib oluliselt vähendada kopsuvähi suremust kõrge riskiga rühmades1,2,3. Alates LDCT laialdasest kasutamisest kopsuvähi sõeluuringul on asümptomaatiliste kopsusõlmede juhuslike radiograafiliste leidude esinemissagedus jätkuvalt suurenenud4. Kopsusõlmed on defineeritud kui kuni 3 cm läbimõõduga fokaalsed hägusused5. Meil on raskusi pahaloomulisuse tõenäosuse hindamisel ja LDCT-l juhuslikult avastatud suure hulga kopsusõlmedega toimetulekul. KT piirangud võivad viia sagedaste järelkontrollide ja valepositiivsete tulemusteni, mis omakorda viib tarbetu sekkumiseni ja üleravimiseni6. Seetõttu on vaja välja töötada usaldusväärsed ja kasulikud biomarkerid, et kopsuvähki varajases staadiumis õigesti tuvastada ja enamikku healoomulisi sõlmi esmasel avastamisel eristada7.
Vere (seerumi, plasma, perifeerse vere mononukleaarsete rakkude) põhjalik molekulaarne analüüs, sealhulgas genoomika, proteoomika või DNA metülatsioon8,9,10, on suurendanud huvi kopsuvähi diagnostiliste biomarkerite avastamise vastu. Samal ajal mõõdavad metaboloomika lähenemisviisid rakulisi lõpp-produkte, mida mõjutavad endogeensed ja eksogeensed toimed, ning seetõttu kasutatakse neid haiguse alguse ja tulemuse ennustamiseks. Vedelkromatograafia-tandem-massispektromeetria (LC-MS) on metaboloomika uuringutes laialdaselt kasutatav meetod tänu oma kõrgele tundlikkusele ja suurele dünaamilisele ulatusele, mis võib hõlmata erinevate füüsikalis-keemiliste omadustega metaboliite11,12,13. Kuigi plasma/seerumi globaalset metaboloomika analüüsi on kasutatud kopsuvähi diagnoosimise14,15,16,17 ja ravi efektiivsusega seotud biomarkerite18 tuvastamiseks, on seerumi metaboliitide klassifikaatorid healoomuliste ja pahaloomuliste kopsu sõlmede eristamiseks veel palju uuritud. - ulatuslikud uuringud.
Adenokartsinoom ja lamerakk-kartsinoom on mitteväikerakulise kopsuvähi (NSCLC) kaks peamist alatüüpi. Erinevad CT-sõeluuringud näitavad, et adenokartsinoom on kopsuvähi kõige levinum histoloogiline tüüp1,19,20,21. Selles uuringus kasutasime ülipeermelist vedelikkromatograafiat-kõrglahutusega massispektromeetriat (UPLC-HRMS), et viia läbi metaboloomika analüüs kokku 695 seerumiproovil, sealhulgas tervetel kontrollisikutel, healoomulistel kopsu sõlmedel ja CT-ga tuvastatud ≤3 cm suurustel proovidel. I staadiumi kopsu adenokartsinoomi skriining. Tuvastasime seerumi metaboliitide paneeli, mis eristab kopsu adenokartsinoomi healoomulistest sõlmedest ja tervetest kontrollisikutest. Raja rikastamise analüüs näitas, et trüptofaani ja glükoosi metabolismi häired on kopsu adenokartsinoomi puhul tavalised muutused võrreldes healoomuliste sõlmede ja tervete kontrollisikutega. Lõpuks kehtestasime ja valideerisime kõrge spetsiifilisuse ja tundlikkusega seerumi ainevahetuse klassifikaatori, et eristada LDCT abil tuvastatud pahaloomulisi ja healoomulisi kopsu sõlmesid, mis võib aidata varajases diferentsiaaldiagnoosis ja riskihindamisel.
Käesolevas uuringus koguti retrospektiivselt soo ja vanuse järgi sobitatud seerumiproovid 174 tervelt kontrollisikult, 292 healoomuliste kopsusõlmedega patsiendilt ja 229 I staadiumi kopsu adenokartsinoomiga patsiendilt. 695 subjekti demograafilised omadused on esitatud lisas tabelis 1.
Nagu joonisel 1a näidatud, koguti Sun Yat-seni ülikooli vähikeskuses kokku 480 seerumiproovi, sealhulgas 174 tervelt kontrollisikult (HC), 170 healoomuliselt sõlmelt (BN) ja 136 I staadiumi kopsu adenokartsinoomi (LA) proovi. Sihipärase metaboolse profiilimise avastuskohort, kasutades ülijõudlusega vedelikkromatograafiat ja kõrgresolutsiooniga massispektromeetriat (UPLC-HRMS). Nagu on näidatud lisajoonisel 1, identifitseeriti LA ja HC, LA ja BN erinevad metaboliidid, et luua klassifikatsioonimudel ja uurida edasist diferentsiaalse raja analüüsi. Sun Yat-seni ülikooli vähikeskuse kogutud 104 proovi ja kahe teise haigla kogutud 111 proovi valideeriti vastavalt sisemiselt ja väliselt.
a Avastamiskohorti uuringupopulatsioon, kellel tehti globaalne seerumi metaboloomika analüüs, kasutades ülipeetud vedelikkromatograafiat ja kõrge eraldusvõimega massispektromeetriat (UPLC-HRMS). b Uuringukohorti 480 seerumiproovi kogumetaboloomi osaline vähimruutude diskriminantanalüüs (PLS-DA), sealhulgas terved kontrollisikud (HC, n = 174), healoomulised sõlmed (BN, n = 170) ja I staadiumi kopsu adenokartsinoom (Los Angeles, n = 136). +ESI, positiivne elektropihustus-ionisatsioonirežiim, -ESI, negatiivne elektropihustus-ionisatsioonirežiim. c–e Metaboliidid, millel on kahes antud rühmas oluliselt erinev arvukus (kahepoolse Wilcoxoni märgiline astaktest, vale avastamise määraga korrigeeritud p-väärtus, FDR <0,05), on näidatud punasega (korduv muutus > 1,2) ja sinisega (korduv muutus < 0,83). ), mis on näidatud vulkaanigraafikul. f Hierarhiline klastrite soojuskaart, mis näitab olulisi erinevusi annoteeritud metaboliitide arvus LA ja BN vahel. Allikasandmed esitatakse allikasandmete failide kujul.
Avastusrühma seerumi metaboliitide 174 HC, 170 BN ja 136 LA koguhulka analüüsiti UPLC-HRMS analüüsi abil. Esmalt näitame, et kvaliteedikontrolli (QC) proovid koonduvad tihedalt järelevalveta peakomponentide analüüsi (PCA) mudeli keskele, mis kinnitab käesoleva uuringu tulemuslikkuse stabiilsust (lisajoonis 2).
Nagu joonisel 1b näidatud osalise vähimruutude meetodil tehtava diskriminantanalüüsi (PLS-DA) abil, leidsime, et LA ja BN ning LA ja HC vahel olid selged erinevused positiivses (+ESI) ja negatiivses (-ESI) elektropihustus-ionisatsioonirežiimis. Siiski ei leitud BN ja HC vahel olulisi erinevusi +ESI ja -ESI tingimustes.
Leidsime LA ja HC vahel 382 erinevat tunnust, LA ja BN vahel 231 erinevat tunnust ning BN ja HC vahel 95 erinevat tunnust (Wilcoxoni märgiline astaktest, FDR <0,05 ja mitmekordne muutus >1,2 või <0,83) (joonis 1c-e). Piike annoteeriti täiendavalt (lisaandmed 3) andmebaasi (mzCloud/HMDB/Chemspideri teek) vastu m/z väärtuse, retentsiooniaja ja fragmentatsiooni massispektri otsingu abil (üksikasjad on kirjeldatud meetodite osas)22. Lõpuks identifitseeriti LA ja BN puhul 33 ja 38 annoteeritud metaboliiti, mille arvukus oli oluliselt erinev (joonis 1f ja lisatabel 2) ning LA ja HC puhul (lisajoonis 3 ja lisatabel 2). Seevastu BN ja HC puhul identifitseeriti ainult 3 metaboliiti, mille arvukus oli oluliselt erinev (lisatabel 2), mis on kooskõlas BN ja HC kattuvusega PLS-DA-s. Need erinevad metaboliidid hõlmavad laia valikut biokeemilisi ühendeid (lisajoonis 4). Kokkuvõttes näitavad need tulemused seerumi metaboliitide olulisi muutusi, mis peegeldavad varajase staadiumi kopsuvähi pahaloomulist transformatsiooni võrreldes healoomuliste kopsu sõlmede või tervete isikutega. Samal ajal viitab BN ja HC seerumi metaboliitide sarnasus sellele, et healoomulistel kopsu sõlmedel võib olla palju ühiseid bioloogilisi omadusi tervete inimestega. Arvestades, et epidermaalse kasvufaktori retseptori (EGFR) geenimutatsioonid on kopsu adenokartsinoomi alatüübi 23 korral sagedased, püüdsime määrata juhtmutatsioonide mõju seerumi metaboliitidele. Seejärel analüüsisime kopsu adenokartsinoomi rühmas 72 EGFR staatusega juhtumi üldist metaboloomilist profiili. Huvitaval kombel leidsime PCA analüüsis võrreldavaid profiile EGFR mutantsete patsientide (n = 41) ja EGFR metsiktüüpi patsientide (n = 31) vahel (lisajoonis 5a). Siiski tuvastasime 7 metaboliiti, mille arvukus oli EGFR mutatsiooniga patsientidel oluliselt muutunud võrreldes metsiktüüpi EGFR-iga patsientidega (t-test, p < 0,05 ja kordsus > 1,2 või < 0,83) (lisajoonis 5b). Enamik neist metaboliitidest (5 7-st) on atsüülkarnitiinid, millel on oluline roll rasvhapete oksüdatsiooniradades.
Nagu joonisel 2a näidatud töövoogudes illustreeritakse, saadi sõlmede klassifitseerimise biomarkerid vähima absoluutse kahanemise operaatorite ja valiku abil, mis põhines 33 diferentsiaalsel metaboliidil, mis tuvastati LA-s (n = 136) ja BN-is (n = 170). Muutujate parim kombinatsioon (LASSO) – binaarne logistiline regressioonimudel. Mudeli usaldusväärsuse testimiseks kasutati kümnekordset ristvalideerimist. Muutujate valikut ja parameetrite regulariseerimist korrigeeritakse tõenäosuse maksimeerimise karistusega parameetriga λ24. Diskrimineeriva mudeli klassifitseerimise toimivuse testimiseks viidi sisemise valideerimise (n = 104) ja välise valideerimise (n = 111) rühmades läbi globaalne metaboloomika analüüs. Selle tulemusena identifitseeriti avastamiskomplektis 27 metaboliiti parima diskrimineeriva mudelina, millel oli suurim keskmine AUC väärtus (joonis 2b), millest 9-l oli LA-s suurenenud aktiivsus ja 18-l vähenenud aktiivsus võrreldes BN-iga (joonis 2c).
Töövoog kopsu sõlmede klassifikaatori loomiseks, sealhulgas parima seerumi metaboliitide paneeli valimine avastamiskomplektis binaarse logistilise regressioonimudeli abil kümnekordse ristvalideerimise abil ja ennustava toimivuse hindamine sisemiste ja väliste valideerimiskomplektide abil. b LASSO regressioonimudeli ristvalideerimise statistika metaboolsete biomarkerite valiku jaoks. Ülaltoodud numbrid tähistavad antud λ juures valitud biomarkerite keskmist arvu. Punane punktiirjoon tähistab vastava lambda juures valitud keskmist AUC väärtust. Hallid vearibad tähistavad minimaalset ja maksimaalset AUC väärtust. Punktiirjoon näitab parimat mudelit 27 valitud biomarkeriga. AUC, ROC-kõvera (vastuvõtja töökarakteristiku) alune pindala. c 27 valitud metaboliidi muutused LA rühmas võrreldes BN rühmaga avastamisrühmas. Punane tulp – aktiveerimine. Sinine tulp on langus. d–f ROC-kõverad, mis näitavad diskrimineeriva mudeli võimsust 27 metaboliidi kombinatsiooni põhjal avastamis-, sisemise ja välise valideerimise komplektides. Allikaandmed on esitatud allikaandmete failide kujul.
Nende 27 metaboliidi kaalutud regressioonikordajate põhjal loodi ennustusmudel (lisa tabel 3). Nendel 27 metaboliidil põhinev ROC-analüüs andis kõvera aluse pindala (AUC) väärtuseks 0,933, avastamisrühma tundlikkuseks 0,868 ja spetsiifilisuseks 0,859 (joonis 2d). Samal ajal saavutas 38 annoteeritud LA ja HC diferentsiaalse metaboliidi hulgas 16 metaboliidi komplekt LA ja HC eristamisel AUC väärtuseks 0,902, tundlikkusega 0,801 ja spetsiifilisusega 0,856 (lisajoonis 6a-c). Samuti võrreldi diferentsiaalsete metaboliitide erinevatel kordsete muutuse läviväärtustel põhinevaid AUC väärtusi. Leidsime, et klassifikatsioonimudel toimis LA ja BN (HC) eristamisel kõige paremini, kui kordse muutuse tase oli seatud väärtusele 1,2 versus 1,5 või 2,0 (lisajoonis 7a, b). 27 metaboliidirühmal põhinevat klassifikatsioonimudelit valideeriti täiendavalt sisemistes ja välistes kohortides. Sisemise valideerimise AUC oli 0,915 (tundlikkus 0,867, spetsiifilisus 0,811) ja välise valideerimise AUC 0,945 (tundlikkus 0,810, spetsiifilisus 0,979) (joonis 2e, f). Laboritevahelise efektiivsuse hindamiseks analüüsiti välises laboris 40 välise kohordi proovi, nagu on kirjeldatud meetodite osas. Klassifikatsiooni täpsus saavutas AUC 0,925 (lisajoonis 8). Kuna kopsu lamerakk-kartsinoom (LUSC) on kopsu adenokartsinoomi (LUAD) järel teine kõige levinum mitteväikerakk-kopsuvähi (NSCLC) alatüüp, testisime ka metaboolsete profiilide valideeritud potentsiaalset kasulikkust. BN ja 16 LUSC juhtu. LUSC ja BN eristamise AUC oli 0,776 (lisajoonis 9), mis näitab kehvemat võimet võrreldes LUAD ja BN eristamisega.
Uuringud on näidanud, et sõlmede suurus kompuutertomograafia (KT) piltidel on positiivses korrelatsioonis pahaloomulisuse tõenäosusega ja jääb sõlmede ravi peamiseks määrajaks25,26,27. NELSONi sõeluuringu suure kohordi andmete analüüs näitas, et pahaloomulisuse risk patsientidel, kellel olid sõlmed alla 5 mm, oli isegi sarnane patsientidele, kellel sõlmed puudusid28. Seetõttu on minimaalne suurus, mis nõuab regulaarset KT-monitooringut, 5 mm, nagu soovitab Briti Rindkerearstide Selts (BTS), ja 6 mm, nagu soovitab Fleischneri Selts29. Siiski on üle 6 mm suurused ja ilma ilmsete healoomuliste tunnusteta sõlmed, mida nimetatakse määramata kopsusõlmedeks (IPN), kliinilises praktikas hindamisel ja ravis endiselt suureks väljakutseks30,31. Järgmisena uurisime, kas sõlme suurus mõjutas metaboloomilisi signatuure, kasutades avastamis- ja sisemise valideerimise kohortide koondproove. Keskendudes 27 valideeritud biomarkerile, võrdlesime kõigepealt HC ja BN alla 6 mm metaboloomide PCA profiile. Leidsime, et enamik HC ja BN andmepunkte kattusid, mis näitab, et seerumi metaboliitide tasemed olid mõlemas rühmas sarnased (joonis 3a). BN-i ja LA puhul jäid tunnuste kaardid erinevate suuruste vahemike lõikes samaks (joonis 3b, c), samas kui 6–20 mm vahemikus täheldati pahaloomuliste ja healoomuliste sõlmede eraldamist (joonis 3d). Selle kohordi AUC oli 0,927, spetsiifilisus 0,868 ja tundlikkus 0,820 6–20 mm suuruste sõlmede pahaloomulisuse ennustamiseks (joonis 3e, f). Meie tulemused näitavad, et klassifikaator suudab tabada varajase pahaloomulise transformatsiooni põhjustatud metaboolseid muutusi, olenemata sõlme suurusest.
ad PCA profiilide võrdlus kindlate rühmade vahel, mis põhinevad 27 metaboliidi metaboolsel klassifikaatoril. CC ja BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. LA 6–20 mm vs LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm ja LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e ROC-kõver, mis näitab diskriminantmudeli toimivust 6–20 mm suuruste sõlmede puhul. f Tõenäosusväärtused arvutati logistilise regressioonimudeli põhjal 6–20 mm suuruste sõlmede puhul. Hall punktiirjoon tähistab optimaalset piirväärtust (0,455). Ülaltoodud numbrid esindavad Los Angelese jaoks prognoositud juhtude protsenti. Kasutage kahepoolset Studendi t-testi. PCA, põhikomponentide analüüs. AUC kõvera alune pindala. Allikasandmed on esitatud allikandmete failide kujul.
Pakutud pahaloomulisuse ennustusmudeli toimivuse illustreerimiseks valiti edasi neli proovi (vanuses 44–61 aastat), kellel olid sarnased kopsu sõlmede suurused (7–9 mm) (joonis 4a, b). Esialgsel sõeluuringul esines juhtum 1 tahke sõlmena koos kaltsifikatsiooniga, mis on healoomulisusega seotud tunnus, samas kui juhtum 2 esines määramata osaliselt tahke sõlmena ilma ilmsete healoomuliste tunnusteta. Kolm järelkontrolli kompuutertomograafia skaneerimisvooru näitasid, et need juhtumid püsisid 4-aastase perioodi jooksul stabiilsena ja seetõttu peeti neid healoomulisteks sõlmedeks (joonis 4a). Võrreldes järjestikuste kompuutertomograafia skaneeringute kliinilise hindamisega tuvastas ühekordse seerumi metaboliidi analüüs praeguse klassifikaatorimudeliga need healoomulised sõlmed kiiresti ja õigesti tõenäosuslike piirangute põhjal (tabel 1). Joonisel 4b on juhtumil 3 näidatud pleura taandumise tunnustega sõlme, mis on kõige sagedamini seotud pahaloomulisusega32. Juhtum 4 esines määramata osaliselt tahke sõlmena ilma healoomulise põhjuse tõenditeta. Kõik need juhtumid ennustati klassifikaatorimudeli kohaselt pahaloomulisteks (tabel 1). Kopsu adenokartsinoomi hindamine viidi läbi histopatoloogilise uuringuga pärast kopsu resektsiooni operatsiooni (joonis 4b). Välise valideerimiskomplekti puhul ennustas metaboolne klassifikaator täpselt kahte määramata kopsu sõlmede juhtu, mis olid suuremad kui 6 mm (lisajoonis 10).
Kahe healoomulise sõlme juhu kopsude aksiaalakna kompuutertomograafia (KT) pildid. Juhul 1 näitas 4 aasta pärast tehtud KT-uuring stabiilset 7 mm läbimõõduga tahket sõlme koos kaltsifikatsiooniga paremas alumises lobis. Juhul 2 näitas 5 aasta pärast tehtud KT-uuring paremas ülemises lobis stabiilset, osaliselt tahket sõlme läbimõõduga 7 mm. b Kahe I staadiumi adenokartsinoomi juhu kopsude aksiaalakna kompuutertomograafia pildid ja vastavad patoloogilised uuringud enne kopsu resektsiooni. Juhtum 3 näitas paremas ülemises lobis 8 mm läbimõõduga sõlme koos pleura retraktsiooniga. Juhtum 4 näitas vasakus ülemises lobis osaliselt tahket lihvklaasist sõlme läbimõõduga 9 mm. Resekteeritud kopsukoe hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimine (skaalariba = 50 μm) näitab kopsu adenokartsinoomi atsinaarset kasvumustrit. Nooled näitavad KT-piltidel tuvastatud sõlmi. H&E-pildid on patoloogi poolt uuritud mitme (>3) mikroskoopilise välja representatiivsed pildid.
Kokkuvõttes näitavad meie tulemused seerumi metaboliitide biomarkerite potentsiaalset väärtust kopsu sõlmede diferentsiaaldiagnostikas, mis võib KT-sõeluuringu hindamisel väljakutseid tekitada.
Valideeritud diferentsiaalse metaboliidi paneeli põhjal püüdsime tuvastada peamiste metaboolsete muutuste bioloogilisi korrelaate. MetaboAnalysti KEGG raja rikastamise analüüs tuvastas kahe antud rühma vahel 6 ühist oluliselt muutunud rada (LA vs. HC ja LA vs. BN, korrigeeritud p ≤ 0,001, efekt > 0,01). Neid muutusi iseloomustasid häired püruvaadi metabolismis, trüptofaani metabolismis, niatsiini ja nikotiinamiidi metabolismis, glükolüüsis, TCA tsüklis ja puriini metabolismis (joonis 5a). Seejärel viisime läbi suunatud metaboloomika, et kontrollida peamisi muutusi absoluutse kvantifitseerimise abil. Ühiste metaboliitide määramine sageli muutunud radades tehti kolmekordse kvadrupoolmassispektromeetria (QQQ) abil, kasutades autentseid metaboliidi standardeid. Metaboloomika uuringu sihtvalimi demograafilised omadused on esitatud lisatabelis 4. Kooskõlas meie üldiste metaboloomika tulemustega kinnitas kvantitatiivne analüüs, et hüpoksantiini ja ksantiini, püruvaadi ja laktaadi sisaldus oli LA-s suurenenud võrreldes BN ja HC-ga (joonis 5b, c, p <0,05). BN ja HC vahel nende metaboliitide osas olulisi erinevusi siiski ei leitud.
KEGG raja rikastamise analüüs oluliselt erinevate metaboliitide osas LA rühmas võrreldes BN ja HC rühmadega. Kasutati kahepoolset globaaltesti ja p-väärtusi korrigeeriti Holmi-Bonferroni meetodi abil (korrigeeritud p ≤ 0,001 ja efekti suurus > 0,01). b–d Viiuli graafikud, mis näitavad hüpoksantiini, ksantiini, laktaadi, püruvaadi ja trüptofaani tasemeid seerumi HC, BN ja LA puhul, määratuna LC-MS/MS abil (n = 70 rühma kohta). Valged ja mustad punktiirjooned näitavad vastavalt mediaani ja kvartiili. e Viiuli graafik, mis näitab SLC7A5 ja QPRT normaliseeritud Log2TPM (transkripte miljoni kohta) mRNA ekspressiooni kopsu adenokartsinoomis (n = 513) võrreldes normaalse kopsukoega (n = 59) LUAD-TCGA andmestikus. Valge kast tähistab interkvartiilide vahemikku, horisontaalne must joon keskel tähistab mediaani ja vertikaalne must joon, mis ulatub kastist välja, tähistab 95% usaldusvahemikku (CI). f Pearsoni korrelatsioonigraafik SLC7A5 ja GAPDH ekspressiooni kohta kopsu adenokartsinoomis (n = 513) ja normaalses kopsukoes (n = 59) TCGA andmestikus. Hall ala tähistab 95% usaldusintervalli. r, Pearsoni korrelatsioonikordaja. g Normaliseeritud rakkude trüptofaani tasemed A549 rakkudes, mis on transfekteeritud mittespetsiifilise shRNA kontrolliga (NC) ja shSLC7A5-ga (Sh1, Sh2), määratud LC-MS/MS abil. Esitatakse viie bioloogiliselt sõltumatu proovi statistiline analüüs igas rühmas. h NADt rakkude tasemed (kogu NAD, sealhulgas NAD+ ja NADH) A549 rakkudes (NC) ja SLC7A5 vaigistatud A549 rakkudes (Sh1, Sh2). Esitatakse kolme bioloogiliselt sõltumatu proovi statistiline analüüs igas rühmas. i A549 rakkude glükolüütilist aktiivsust enne ja pärast SLC7A5 vaigistamist mõõdeti rakuvälise hapestumise kiiruse (ECAR) abil (n = 4 bioloogiliselt sõltumatut proovi rühma kohta). 2-DG,2-deoksü-D-glükoos. Kahepoolset Studendi t-testi kasutati töödes (b–h). Töödes (g–i) tähistavad vearibad keskmist ± standardhälvet, iga katset tehti kolm korda sõltumatult ja tulemused olid sarnased. Allikasandmed on esitatud allikandmete failide kujul.
Arvestades trüptofaani metabolismi muutuste olulist mõju LA rühmas, hindasime ka seerumi trüptofaani taset HC, BN ja LA rühmades, kasutades QQQ-d. Leidsime, et seerumi trüptofaani tase oli LA rühmas madalam võrreldes HC või BN rühmaga (p < 0,001, joonis 5d), mis on kooskõlas varasemate leidudega, et kopsuvähiga patsientidel on vereringes trüptofaani tase madalam kui kontrollrühma tervetel kontrollisikutel33,34,35. Teises uuringus, milles kasutati PET/KT märgistusainet 11C-metüül-L-trüptofaani, leiti, et trüptofaani signaali retentsiooniaeg kopsuvähi koes oli oluliselt pikenenud võrreldes healoomuliste kahjustuste või normaalse koega36. Meie hüpotees on, et trüptofaani vähenemine LA seerumis võib peegeldada aktiivset trüptofaani omastamist kopsuvähirakkude poolt.
Samuti on teada, et trüptofaani katabolismi künureniini raja lõpp-produkt on NAD+37,38, mis on oluline substraat glütseraldehüüd-3-fosfaadi ja 1,3-bisfosfoglütseraadi reaktsioonil glükolüüsis39. Kuigi varasemad uuringud on keskendunud trüptofaani katabolismi rollile immuunregulatsioonis, püüdsime selgitada trüptofaani düsregulatsiooni ja glükolüütiliste radade vahelist koostoimet, mida täheldati käesolevas uuringus. Lahustunud transporterite perekonna 7. liige 5 (SLC7A5) on teadaolevalt trüptofaani transporter43,44,45. Kinoliinhappe fosforibosüültransferaas (QPRT) on ensüüm, mis asub künureniini rajast allavoolu ja muundab kinoliinhappe NAMN-iks46. LUAD TCGA andmestiku uurimine näitas, et nii SLC7A5 kui ka QPRT olid kasvajakoes võrreldes normaalse koega oluliselt ülesreguleeritud (joonis 5e). Seda suurenemist täheldati kopsu adenokartsinoomi I ja II staadiumis, samuti III ja IV staadiumis (lisajoonis 11), mis näitab trüptofaani metabolismi varajasi häireid, mis on seotud kasvaja tekkega.
Lisaks näitas LUAD-TCGA andmestik positiivset korrelatsiooni SLC7A5 ja GAPDH mRNA ekspressiooni vahel vähihaigete proovides (r = 0,45, p = 1,55E-26, joonis 5f). Seevastu normaalses kopsukoes ei leitud selliste geenisignatuuride vahel olulist korrelatsiooni (r = 0,25, p = 0,06, joonis 5f). SLC7A5 pärssimine (lisajoonis 12) A549 rakkudes vähendas oluliselt rakkude trüptofaani ja NAD(H) taset (joonis 5g, h), mille tulemuseks oli glükolüütilise aktiivsuse nõrgenemine, mida mõõdeti rakuvälise hapestumise kiiruse (ECAR) abil (joonis 1). 5i). Seega, tuginedes seerumi metaboolsetele muutustele ja in vitro tuvastamisele, püstitame hüpoteesi, et trüptofaani metabolism võib toota NAD+ künureniini raja kaudu ja mängida olulist rolli glükolüüsi soodustamisel kopsuvähis.
Uuringud on näidanud, et suur hulk LDCT-ga avastatud määramata kopsu sõlmesid võib viia vajaduseni täiendavate uuringute, näiteks PET-KT, kopsubiopsia ja valepositiivse pahaloomulise kasvaja diagnoosi tõttu üleravi järele.31 Nagu joonisel 6 näidatud, tuvastas meie uuring potentsiaalse diagnostilise väärtusega seerumi metaboliitide paneeli, mis võib parandada CT-ga avastatud kopsu sõlmede riski hindamist ja edasist ravi.
Kopsu sõlmede hindamiseks kasutatakse madala doosiga kompuutertomograafiat (LDKT), mille pildilised tunnused viitavad healoomulistele või pahaloomulistele põhjustele. Sõlmede ebakindel tulemus võib viia sagedaste järelkontrolli visiitide, tarbetute sekkumiste ja üleravimiseni. Diagnostilise väärtusega seerumi ainevahetuse klassifikaatorite kaasamine võib parandada kopsu sõlmede riskihindamist ja edasist ravi. PET-positronemissioontomograafia.
USA NLST uuringu ja Euroopa NELSON uuringu andmed näitavad, et kõrge riskiga rühmade skriining madala doosiga kompuutertomograafiaga (LDCT) võib vähendada kopsuvähi suremust1,3. Siiski on LDCT abil avastatud suure hulga juhuslike kopsusõlmede riskihindamine ja sellele järgnev kliiniline ravi endiselt kõige keerulisem. Peamine eesmärk on optimeerida olemasolevate LDCT-põhiste protokollide õiget klassifitseerimist usaldusväärsete biomarkerite kaasamise abil.
Teatud molekulaarsed biomarkerid, näiteks vere metaboliidid, on tuvastatud kopsuvähi ja tervete kontrollisikute võrdlemisel15,17. Käesolevas uuringus keskendusime seerumi metaboloomika analüüsi rakendamisele, et eristada healoomulisi ja pahaloomulisi kopsu sõlmesid, mis on juhuslikult avastatud LDCT-ga. Võrdlesime tervete kontrollisikute (HC), healoomuliste kopsu sõlmede (BN) ja I staadiumi kopsu adenokartsinoomi (LA) proovide üldist seerumi metaboloomi UPLC-HRMS analüüsi abil. Leidsime, et HC-l ja BN-il olid sarnased metaboolsed profiilid, samas kui LA-l ilmnesid olulised muutused võrreldes HC ja BN-ga. Tuvastasime kaks seerumi metaboliitide komplekti, mis eristavad LA-d HC-st ja BN-ist.
Praegune LDCT-l põhinev healoomuliste ja pahaloomuliste sõlmede identifitseerimisskeem põhineb peamiselt sõlmede suurusel, tihedusel, morfoloogial ja kasvukiirusel aja jooksul30. Varasemad uuringud on näidanud, et sõlmede suurus on tihedalt seotud kopsuvähi tõenäosusega. Isegi kõrge riskiga patsientidel on pahaloomulisuse risk alla 6 mm suuruste sõlmede puhul <1%. 6–20 mm suuruste sõlmede pahaloomulisuse risk jääb vahemikku 8% kuni 64%30. Seetõttu soovitab Fleischneri Selts rutiinse kompuutertomograafia järelkontrolli jaoks 6 mm läviväärtust.29 Määramata kopsusõlmede (IPN), mis on suuremad kui 6 mm, riskihindamist ja ravi ei ole aga piisavalt läbi viidud31. Kaasasündinud südamehaiguste praegune ravi põhineb tavaliselt valvsal ootamisel koos sagedase kompuutertomograafia jälgimisega.
Valideeritud metaboloomi põhjal näitasime esmakordselt metaboloomsete signatuuride kattumist tervete indiviidide ja healoomuliste <6 mm sõlmede vahel. Bioloogiline sarnasus on kooskõlas varasemate KT leidudega, mille kohaselt on <6 mm sõlmede pahaloomulisuse risk sama madal kui sõlmedeta isikutel.30 Tuleb märkida, et meie tulemused näitavad ka, et healoomulistel <6 mm ja ≥6 mm sõlmedel on metaboloomsete profiilide osas suur sarnasus, mis viitab sellele, et healoomulise etioloogia funktsionaalne määratlus on järjepidev olenemata sõlme suurusest. Seega võivad tänapäevased diagnostilised seerumi metaboliitide paneelid pakkuda ühte analüüsi välistamistestina, kui sõlmed esmakordselt KT-l avastatakse, ja potentsiaalselt vähendada järjestikust jälgimist. Samal ajal eristas sama metaboolsete biomarkerite paneel ≥6 mm suuruseid pahaloomulisi sõlmi healoomulistest sõlmedest ja andis täpsed ennustused sarnase suurusega ja ebamääraste morfoloogiliste tunnustega IPN-ide kohta KT-piltidel. See seerumi metabolismi klassifikaator toimis hästi ≥6 mm sõlmede pahaloomulisuse ennustamisel AUC-ga 0,927. Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et ainulaadsed seerumi metaboolsed signatuurid võivad spetsiifiliselt peegeldada varajasi kasvaja poolt põhjustatud metaboolseid muutusi ja omada potentsiaalset väärtust riski ennustajatena, olenemata sõlme suurusest.
Tähelepanuväärselt on kopsu adenokartsinoom (LUAD) ja lamerakk-kartsinoom (LUSC) peamised mitteväikerakulise kopsuvähi (NSCLC) tüübid. Arvestades, et LUSC on tugevalt seotud tubaka tarvitamisega47 ja LUAD on CT-sõeluuringul juhuslike kopsu sõlmede kõige levinum histoloogia48, loodi meie klassifikaatorimudel spetsiaalselt I staadiumi adenokartsinoomi proovide jaoks. Wang ja tema kolleegid keskendusid samuti LUAD-ile ja tuvastasid lipiidide abil üheksa lipiidi signatuuri, et eristada varajases staadiumis kopsuvähki tervetest inimestest17. Testisime praegust klassifikaatorimudelit 16 I staadiumi LUSC ja 74 healoomulise sõlme juhul ning täheldasime madalat LUSC ennustamistäpsust (AUC 0,776), mis viitab sellele, et LUAD-il ja LUSC-l võivad olla oma metaboloomilised signatuurid. Tõepoolest, on näidatud, et LUAD ja LUSC erinevad etioloogia, bioloogilise päritolu ja geneetiliste aberratsioonide poolest49. Seetõttu tuleks sõeluuringuprogrammides kopsuvähi populatsioonipõhiseks avastamiseks mõeldud treeningmudelitesse kaasata ka muud tüüpi histoloogiat.
Selles uuringus tuvastasime kopsu adenokartsinoomi kuus kõige sagedamini muutunud rada võrreldes tervete kontrollisikute ja healoomuliste sõlmedega. Ksantiin ja hüpoksantiin on puriinide ainevahetusraja tavalised metaboliidid. Kooskõlas meie tulemustega olid puriinide metabolismiga seotud vaheühendid kopsu adenokartsinoomiga patsientide seerumis või kudedes oluliselt suurenenud võrreldes tervete kontrollisikute või invasiivse staadiumiga patsientidega15,50. Kõrgenenud seerumi ksantiini ja hüpoksantiini tase võib peegeldada kiiresti prolifereeruvate vähirakkude jaoks vajalikku anabolismi. Glükoosi metabolismi düsregulatsioon on vähi metabolismi tuntud tunnus51. Selles uuringus täheldasime LA rühmas püruvaadi ja laktaadi olulist suurenemist võrreldes HC ja BN rühmaga, mis on kooskõlas varasemate aruannetega glükolüütilise raja kõrvalekallete kohta mitteväikerakulise kopsuvähi (NSCLC) patsientide ja tervete kontrollisikute seerumi metaboliidiprofiilides. Tulemused on järjepidevad52,53.
Oluline on see, et kopsu adenokartsinoomide seerumis täheldasime pöördvõrdelist seost püruvaadi ja trüptofaani metabolismi vahel. Seerumi trüptofaani tase oli LA rühmas madalam võrreldes HC või BN rühmaga. Huvitaval kombel leidis varasem ulatuslik uuring prospektiivse kohorti abil, et madal trüptofaani tase vereringes oli seotud kopsuvähi suurenenud riskiga54. Trüptofaan on asendamatu aminohape, mida saame täielikult toidust. Järeldame, et seerumi trüptofaani ammendumine kopsu adenokartsinoomi korral võib peegeldada selle metaboliidi kiiret ammendumist. On hästi teada, et trüptofaani katabolismi lõpp-produkt künureniini raja kaudu on de novo NAD+ sünteesi allikas. Kuna NAD+ toodetakse peamiselt päästeraja kaudu, on NAD+ tähtsus trüptofaani metabolismis tervise ja haiguste korral veel kindlaks määramata46. Meie TCGA andmebaasi analüüs näitas, et trüptofaani transporteri lahustunud transporteri 7A5 (SLC7A5) ekspressioon oli kopsu adenokartsinoomi korral võrreldes normaalsete kontrollisikutega oluliselt suurenenud ja oli positiivses korrelatsioonis glükolüütilise ensüümi GAPDH ekspressiooniga. Varasemad uuringud on peamiselt keskendunud trüptofaani katabolismi rollile kasvajavastase immuunvastuse pärssimisel40,41,42. Siin demonstreerime, et trüptofaani omastamise pärssimine SLC7A5 vaigistamise teel kopsuvähirakkudes põhjustab järgnevat rakulise NAD taseme langust ja samaaegset glükolüütilise aktiivsuse nõrgenemist. Kokkuvõttes annab meie uuring bioloogilise aluse seerumi metabolismi muutustele, mis on seotud kopsu adenokartsinoomi pahaloomulise transformatsiooniga.
EGFR-mutatsioonid on mitteväikerakk-kopsuvähiga (NSCLC) patsientidel kõige levinumad juhtmutatsioonid. Meie uuringus leidsime, et EGFR-mutatsiooniga patsientidel (n = 41) olid üldised metaboloomilised profiilid sarnased metsiktüüpi EGFR-iga patsientidega (n = 31), kuigi leidsime mõnedel EGFR-mutandiga patsientidel atsüülkarnitiiniga patsientidel madalamat seerumitaset. Atsüülkarnitiinide väljakujunenud ülesanne on transportida atsüülrühmi tsütoplasmast mitokondriaalsesse maatriksisse, mis viib rasvhapete oksüdeerumiseni energia tootmiseks55. Kooskõlas meie leidudega tuvastas hiljutine uuring ka sarnaseid metaboloomiprofiile EGFR-mutandi ja EGFR-metsiktüüpi kasvajate vahel, analüüsides 102 kopsu adenokartsinoomi koeproovi globaalset metaboloomi50. Huvitaval kombel leiti atsüülkarnitiini sisaldust ka EGFR-mutantide rühmas. Seetõttu võib edasist uurimist vajada, et teha kindlaks, kas atsüülkarnitiini taseme muutused peegeldavad EGFR-i poolt indutseeritud metaboolseid muutusi ja nende aluseks olevaid molekulaarseid radasid.
Kokkuvõtteks võib öelda, et meie uuring loob seerumi metaboolse klassifikaatori kopsu sõlmede diferentsiaaldiagnostikaks ja pakub välja töövoo, mis optimeerib riskihindamist ja hõlbustab kliinilist ravi kompuutertomograafia sõeluuringu põhjal.
Selle uuringu kiitsid heaks Sun Yat-seni Ülikooli Vähihaigla eetikakomitee, Sun Yat-seni Ülikooli Esimene Liithaigla ja Zhengzhou Ülikooli Vähihaigla eetikakomitee. Avastamis- ja sisemise valideerimise rühmas koguti 174 seerumit tervetelt inimestelt ja 244 seerumit healoomulistest sõlmedest isikutelt, kes käisid iga-aastastel tervisekontrollidel Sun Yat-seni Ülikooli Vähikeskuse Vähikontrolli ja Ennetamise Osakonnas, ning 166 healoomulist sõlme. I staadiumi kopsu adenokartsinoomi koguti Sun Yat-seni Ülikooli Vähikeskusest. Välise valideerimise kohordis oli 48 healoomulise sõlme juhtu, 39 I staadiumi kopsu adenokartsinoomi juhtu Sun Yat-seni Ülikooli Esimesest Liithaiglast ja 24 I staadiumi kopsu adenokartsinoomi juhtu Zhengzhou Vähihaiglast. Sun Yat-seni Ülikooli Vähikeskus kogus ka 16 I staadiumi lamerakulise kopsuvähi juhtu, et testida kehtestatud metaboolse klassifikaatori diagnostilist võimekust (patsientide omadused on esitatud lisatabelis 5). Avastuskohorti ja sisemise valideerimise kohordi proovid koguti jaanuari 2018 ja mai 2020 vahel. Välise valideerimise kohordi proovid koguti augusti 2021 ja oktoobri 2022 vahel. Soolise eelarvamuse minimeerimiseks määrati igasse kohorti ligikaudu võrdne arv mees- ja naisjuhtumeid. Avastusmeeskond ja sisemine läbivaatamismeeskond. Osalejate sugu määrati enesehinnangu põhjal. Kõigilt osalejatelt saadi teadlik nõusolek ja hüvitist ei makstud. Healoomuliste sõlmedega subjektideks olid need, kellel oli analüüsi ajal stabiilne kompuutertomograafia skoor 2 kuni 5 aasta möödudes, välja arvatud üks juhtum välise valideerimise proovist, mis koguti enne operatsiooni ja diagnoositi histopatoloogia abil. Erandiks oli krooniline bronhiit. Kopsu adenokartsinoomi juhtumid koguti enne kopsu resektsiooni ja kinnitati patoloogilise diagnoosiga. Paastuvereproovid koguti seerumi eralduskatsutitesse ilma antikoagulantideta. Vereproove hüübiti 1 tund toatemperatuuril ja seejärel tsentrifuugiti 2851 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C seerumi supernatandi kogumiseks. Seerumi alikvoodid külmutati temperatuuril -80 °C kuni metaboliidi ekstraheerimiseni. Sun Yat-seni ülikooli vähikeskuse vähi ennetamise ja meditsiinilise läbivaatuse osakond kogus 100 tervelt doonorilt seerumit, sealhulgas võrdsel arvul 40–55-aastastelt meestelt ja naistelt. Iga doonori proovist segati võrdsed mahud, saadud segu jaotati alikvootideks ja säilitati temperatuuril –80 °C. Seerumisegu kasutati võrdlusmaterjalina kvaliteedikontrolliks ja andmete standardiseerimiseks.
Võrdlusseerum ja testproovid sulatati ning metaboliidid ekstraheeriti kombineeritud ekstraheerimismeetodi (MTBE/metanool/vesi) abil.56 Lühidalt, 50 μl seerumit segati 225 μl jääkülma metanooli ja 750 μl jääkülma metüül-tert-butüüleetriga (MTBE). Segu segati ja inkubeeriti jääl 1 tund. Seejärel segati proovid ja segati keerissegistis 188 μl MS-kvaliteediga veega, mis sisaldas sisemisi standardeid (13C-laktaat, 13C3-püruvaat, 13C-metioniin ja 13C6-isoleutsiin, ostetud Cambridge Isotope Laboratories'ilt). Seejärel tsentrifuugiti segu 15 000 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C ja alumine faas viidi kahte katseklaasi (igaüks 125 μl) LC-MS analüüsiks positiivses ja negatiivses režiimis. Lõpuks aurustati proov kuivaks kiirel vaakumkontsentraatoril.
Kuivatatud metaboliidid lahustati 120 μl 80% atsetonitriilis, segati vorteksil 5 minutit ja tsentrifuugiti kiirusel 15 000 × g 10 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatandid viidi metaboloomika uuringuteks merevaigukollastesse klaasviaalidesse, millel olid mikroinsertid. Sihtimata metaboloomika analüüs ülijõudlusega vedelikkromatograafia-kõrglahutusega massispektromeetria (UPLC-HRMS) platvormil. Metaboliidid eraldati Dionex Ultimate 3000 UPLC süsteemi ja ACQUITY BEH amiidkolonni (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) abil. Positiivsete ioonide režiimis olid liikuvad faasid 95% (A) ja 50% atsetonitriil (B), millest igaüks sisaldas 10 mmol/L ammooniumatsetaati ja 0,1% sipelghapet. Negatiivses režiimis sisaldasid mobiilsed faasid A ja B vastavalt 95% ja 50% atsetonitriili, mõlemad faasid sisaldasid 10 mmol/l ammooniumatsetaati, pH = 9. Gradientprogramm oli järgmine: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. Kolonni hoiti automaatse proovivõtja temperatuuril 40 °C ja proovi temperatuuril 10 °C. Voolukiirus oli 0,3 ml/min, süstimismaht oli 3 μl. Q-Exactive Orbitrap massispektromeeter (Thermo Fisher Scientific) elektropihustus-ionisatsiooniallikaga (ESI) töötas täisskaneerimise režiimis ja oli ühendatud ddMS2 jälgimisrežiimiga suurte andmemahtude kogumiseks. MS-parameetrid määrati järgmiselt: pihustuspinge +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillaari temperatuur 320 °C, kaitsegaas 40 arb, abilaas 10 arb, sondi küttekeha temperatuur 350 °C, skaneerimisulatus 70–1050 m/h, lahutusvõime 70 000. Andmed saadi Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) abil.
Andmete kvaliteedi hindamiseks genereeriti koondatud kvaliteedikontrolli (QC) proovid, võttes igast proovist 10 μl alikvoote supernatandist. Analüütilise järjestuse alguses analüüsiti kuut kvaliteedikontrolli proovi süstimist, et hinnata UPLC-MS süsteemi stabiilsust. Seejärel lisatakse partiisse perioodiliselt kvaliteedikontrolli proove. Kõiki 11 seerumiproovide partiid selles uuringus analüüsiti LC-MS abil. 100 terve doonori seerumi segu alikvoote kasutati vastavates partiides võrdlusmaterjalina, et jälgida ekstraheerimisprotsessi ja korrigeerida partiidevahelisi mõjusid. Avastuskohorti, sisemise valideerimise kohordi ja välise valideerimise kohordi sihtimata metaboloomika analüüs viidi läbi Sun Yat-seni ülikooli metaboloomika keskuses. Guangdongi tehnikaülikooli analüüsi- ja testimiskeskuse välislabor analüüsis samuti 40 välise kohordi proovi, et testida klassifikaatori mudeli toimivust.
Pärast ekstraheerimist ja lahustamist mõõdeti seerumi metaboliitide absoluutset kvantifitseerimist ülikõrgefektiivse vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetria abil (Agilent 6495 kolmik-kvadrupool) elektropihustus-ionisatsiooniallikaga (ESI) mitme reaktsiooni jälgimise (MRM) režiimis. Metaboliitide eraldamiseks kasutati ACQUITY BEH amiidkolonni (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Liikuv faas koosnes 90% (A) ja 5% atsetonitriilist (B) koos 10 mmol/L ammooniumatsetaadi ja 0,1% ammoniaagilahusega. Gradientprogramm oli järgmine: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0%B. Kolonni hoiti automaatse proovivõtja temperatuuril 40 °C ja proovi temperatuuril 10 °C. Voolukiirus oli 0,3 ml/min ja süstimismaht oli 1 μL. MS-parameetrid määrati järgmiselt: kapillaarpinge ±3,5 kV, nebulisaatori rõhk 35 psi, kattegaasvool 12 l/min, kattegaastemperatuur 350 °C, kuivatusgaasi temperatuur 250 °C ja kuivatusgaasi vool 14 l/min. Trüptofaani, püruvaadi, laktaadi, hüpoksantiini ja ksantiini MRM-konversioonid olid vastavalt 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 ja 151,0–107,9. Andmed koguti Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) abil. Seerumiproovide puhul kvantifitseeriti trüptofaani, püruvaadi, laktaadi, hüpoksantiini ja ksantiini sisaldus, kasutades standardlahuste segude kalibreerimiskõveraid. Rakuproovide puhul normaliseeriti trüptofaani sisaldus sisestandardi ja rakuvalgu massi suhtes.
Piikide ekstraheerimine (m/z ja retentsiooniaeg (RT)) viidi läbi, kasutades Compound Discovery 3.1 ja TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Partiidevaheliste võimalike erinevuste kõrvaldamiseks jagati iga testproovi iseloomulik piik sama partii võrdlusmaterjali iseloomuliku piigiga, et saada suhteline küllus. Sisestandardite suhtelised standardhälbed enne ja pärast standardiseerimist on esitatud lisas tabelis 6. Kahe rühma erinevusi iseloomustati vale avastamise määraga (FDR < 0,05, Wilcoxoni märgiga astaktest) ja muutuse (> 1,2 või < 0,83) abil. Ekstraheeritud tunnuste toor-MS-andmed ja võrdlusseerumi suhtes korrigeeritud MS-andmed on esitatud vastavalt lisaandmetes 1 ja lisaandmetes 2. Piikide annotatsioon viidi läbi nelja määratletud identifitseerimistaseme alusel, sealhulgas tuvastatud metaboliidid, oletatavalt annoteeritud ühendid, oletatavalt iseloomustatud ühendite klassid ja tundmatud ühendid 22. Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) andmebaasiotsingute põhjal valiti diferentsiaalse metaboliidi vahelisteks vaheühenditeks lõpuks bioloogilised ühendid, mille MS/MS vastas valideeritud standarditele või täpse vaste annotatsioonidele mzCloudis (skoor > 85) või Chemspideris. Iga tunnuse tipp-annotatsioonid on lisatud lisaandmetesse 3. MetaboAnalyst 5.0 kasutati summaarselt normaliseeritud metaboliitide arvukuse ühemuutuja analüüsiks. MetaboAnalyst 5.0 hindas ka KEGG raja rikastamise analüüsi oluliselt erinevate metaboliitide põhjal. Põhikomponentide analüüsi (PCA) ja osalist vähimruutude diskriminantanalüüsi (PLS-DA) analüüsiti ropls tarkvarapaketi (v.1.26.4) abil, kasutades pinu normaliseerimist ja automaatset skaleerimist. Optimaalne metaboliidi biomarkeri mudel sõlme pahaloomulisuse ennustamiseks genereeriti binaarse logistilise regressiooni abil, kasutades vähima absoluutse kahanemise ja valikuoperaatorit (LASSO, R pakett v.4.1-3). Diskrimineeriva mudeli toimivust tuvastus- ja valideerimisandmikes iseloomustati AUC hindamisega ROC analüüsi põhjal vastavalt pROC paketile (v.1.18.0.). Optimaalne tõenäosuslik piirväärtus saadi mudeli maksimaalse Youdeni indeksi (tundlikkus + spetsiifilisus – 1) põhjal. Proovid, mille väärtused on lävest väiksemad või suuremad, ennustatakse vastavalt healoomuliste sõlmedena ja kopsu adenokartsinoomina.
A549 rakke (#CCL-185, American Type Culture Collection) kasvatati F-12K söötmes, mis sisaldas 10% FBS-i. SLC7A5-le suunatud lühikese juuksenõelakujulise RNA (shRNA) järjestused ja mittesihtiv kontroll (NC) sisestati lentiviiruse vektorisse pLKO.1-puro. shSLC7A5 antisenss-järjestused on järgmised: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5 (#5347) ja tubuliini (#2148) vastased antikehad osteti firmalt Cell Signaling Technology. Western blot analüüsiks kasutati SLC7A5 ja tubuliini vastaseid antikehi lahjenduses 1:1000.
Seahorse XF glükolüütilise stressi test mõõdab rakuvälise happesuse (ECAR) taset. Analüüsis manustati järjestikku glükoosi, oligomütsiin A-d ja 2-DG-d, et testida ECAR-i abil mõõdetud rakulist glükolüütilist võimekust.
Mittesihtiva kontrolliga (NC) ja shSLC7A5-ga (Sh1, Sh2) transfekteeritud A549 rakud külvati üleöö 10 cm läbimõõduga tassidesse. Rakkude metaboliite ekstraheeriti 1 ml jääkülma 80% metanooli vesilahusega. Metanoolilahuses olevad rakud kraabiti ära, koguti uude katseklaasi ja tsentrifuugiti kiirusel 15 000 × g 15 minutit temperatuuril 4 °C. Koguti 800 µl supernatanti ja kuivatati kiire vaakumkontsentraatori abil. Seejärel analüüsiti kuivatatud metaboliitide pelleteid trüptofaani taseme suhtes, kasutades LC-MS/MS-i, nagu eespool kirjeldatud. Rakkude NAD(H) tasemeid A549 rakkudes (NC ja shSLC7A5) mõõdeti kvantitatiivse NAD+/NADH kolorimeetrilise komplekti (#K337, BioVision) abil vastavalt tootja juhistele. Metaboliitide hulga normaliseerimiseks mõõdeti iga proovi valgu taset.
Valimi suuruse esialgseks määramiseks ei kasutatud statistilisi meetodeid. Varasemaid biomarkerite avastamisele suunatud metaboloomika uuringuid15,18 on peetud suuruse määramise võrdlusalusteks ja võrreldes nende aruannetega oli meie valim piisav. Uuringukohortist ei jäetud ühtegi proovi välja. Seerumiproovid määrati juhuslikult avastusrühma (306 juhtu, 74,6%) ja sisemise valideerimise rühma (104 juhtu, 25,4%) sihtimata metaboloomika uuringute jaoks. Samuti valisime suunatud metaboloomika uuringute jaoks avastusrühmast juhuslikult 70 juhtu igast rühmast. Uurijatele tehti LC-MS andmete kogumise ja analüüsi ajal rühmade määramise osas pimedaks. Metaboloomika andmete ja rakukatsete statistilist analüüsi on kirjeldatud vastavates tulemuste, jooniste legendide ja meetodite osades. Rakulise trüptofaani, NADT ja glükolüütilise aktiivsuse kvantifitseerimine viidi läbi kolm korda sõltumatult, saades identsed tulemused.
Lisateavet uuringu ülesehituse kohta leiate selle artikliga seotud loodusportfelli aruande kokkuvõttest.
Ekstraheeritud tunnuste toor-MS-andmed ja võrdlusseerumi normaliseeritud MS-andmed on esitatud vastavalt lisaandmetes 1 ja lisaandmetes 2. Diferentsiaaltunnuste tipp-annotatsioonid on esitatud lisaandmetes 3. LUAD TCGA andmestiku saab alla laadida aadressilt https://portal.gdc.cancer.gov/. Graafiku joonistamiseks vajalikud sisendandmed on esitatud allikandmetes. Allikandmed on esitatud selle artikli jaoks.
Riiklik kopsu sõeluuringute uurimisrühm jt. Kopsuvähi suremuse vähendamine madala doosiga kompuutertomograafia abil. Põhja-Inglismaa. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ja Prophet, PC. Kopsuvähi sõeluuring madala doosiga spiraalse kompuutertomograafiaga: riikliku kopsu sõeluuringu (NLST) tulemused. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ jt. Kopsuvähi suremuse vähendamine volumetrilise kompuutertomograafia abil randomiseeritud uuringus. Põhja-Inglismaa. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Postituse aeg: 18. september 2023